一种卵巢早衰相关基因全外显子扩增及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物基因检测技术领域，旨在提供一种卵巢早衰相关基因全外显子扩增及检测方法。包括以下步骤：从检测材料中提取基因组DNA；利用SEQ ID NO：1～120共120条引物，针对FMR1、FOXL2、FSHR、POF1B、INHA、NOBOX、GDF9、BMP15、FIGLA共9个基因全部外显子进行扩增试验；扩增试验及阴性对照共计61个PCR反应是同步进行的，120条引物的Tm值范围为57～62℃；采用琼脂糖电泳和凝胶成像系统对扩增产物进行检测；使用自动测序仪对扩增产物的测序结果进行分析。本发明专利技术通过优化的PCR扩增特异性同步扩增了与卵巢早衰相关的9个基因的全部外显子，为下游的检测提供了检测原材料。操作简便，扩增时间短，特异性强，重复性好。大大提高了检出的阳性率，应用前景广阔。

A method of amplification and detection of all exons of genes related to premature ovarian failure

【技术实现步骤摘要】
一种卵巢早衰相关基因全外显子扩增及检测方法
本专利技术涉及生物基因检测
，具体为一种卵巢早衰相关基因全外显子扩增及检测方法。
技术介绍
卵巢早衰(prematureovarianfailure,POF)是指月经初潮年龄正常或延迟、第二性征发育正常的女性，在40岁之前出现围绝经期综合征等症状，持续6个月以上闭经，生殖器官萎缩，性功能降低甚至不孕，促卵泡激素(folliclestimulatinghormone,FSH)和黄体生成素(luteinizinghormone,LH)质量浓度升高，雌二醇(Estradiol2,E2)质量浓度降低的一种妇科内分泌性疾病。国内外对卵巢早衰的研究表明，卵巢早衰患者在基因组水平存在某些基因发生突变的现象，卵巢早衰与基因突变关联性研究成果使基因筛查成为可能。研究表明：FMR1、FOXL2、FSHR、POF1B、INHA、NOBOX、GDF9、BMP15、FIGLA9个基因与卵巢早衰发病显著相关。9个基因中FMR1位于X染色体上，为脆性X染色体智力低下1号基因，FMR1基因突变与POF发病之间存在显著关系，在携带FMR1基因突变的妇女中POF发病率为13-26％；FOXL2基因是第一个被认定在维持卵巢功能方面发挥重要作用的人类常染色体基因，参与眼睑的早期发育并有助于卵巢滤泡细胞的发育和维持，该基因突变会导致包括卵巢功能不全在内的先天性睑裂狭小综合征(BPES)；FSHR基因编码蛋白为卵泡刺激素受体，主要表达与卵巢颗粒细胞及卵母细胞表面，在初始卵泡即开始表达，之后表达量逐渐增加直到排卵前卵泡，优势卵泡的出现主要靠FSH-FSHR信号通路调节，从芬兰学者1995年首次发现FSHR基因突变与POF相关之后，陆续有各国学者报道了FSHR基因不同点突变与POF发病之间的关联，因此FSHR基因突变时POF发病的一个重要病理生理基础；POF1B基因位于X染色体上一个对卵巢功能维持极为关键的区域即Xq13.3-q26/27，其能逃脱X染色体失活的作用，有研究表明其基因突变会影响POF1B蛋白与非肌源性肌丝蛋白结合而影响卵巢功能；INHA基因可编码一系列TGFbeta家族相关分子，抑制垂体合成及分泌FSH激素，INHA基因功能障碍导致FSH水平过高，招募过多卵泡最终导致卵泡池提前耗竭，因此IHNA基因突变也是POF病因之一，已有多个研究证实其某些基因多态性与POF发病相关；NOBOX基因编码的蛋白为一个在卵子发育过程中起关键作用的转录因子，其在卵巢中的表达局限于卵母细胞，在卵子发育早期起着重要作用，已有研究表明该基因某些突变会阻碍NOBOX蛋白与DNA的结合，从而阻止其发挥正常调节功能，导致卵巢早衰，如p.Arg355His突变等；GDF9基因编码的蛋白为TGFbeta家族的成员之一，其前体蛋白最终被加工成一个卵源性分泌因子在卵泡发育过程中扮演重要角色，成熟的GDF9因子可促进扁平的始基卵泡颗粒细胞分化为立方形的成熟颗粒细胞即始基卵泡的活化过程，由于GDF9编码的前体蛋白要经历一系列的翻译后修饰成为一个成熟的分泌因子，因此其基因突变无论是影响GDF9基因的翻译活性或是位于关键结构域影响蛋白的翻译后修饰过程的均会导致GDF9蛋白功能障碍，最终导致卵巢早衰；BMP15基因位于X染色体的Xp11.22.位置，包括两个外显子区，最主要表达在卵巢中的卵母细胞中，BMP15主要的生物学功能包括：(1)促进卵泡生长及成熟(从不依赖于促性腺激素的原始卵泡期开始)；(2)调节颗粒细胞对促卵泡生成素(FSH)作用的敏感性，决定卵泡排出的比例；(3)预防颗粒细胞凋亡；(4)促进卵泡的发育潜能。BMP15基因的错意突变目前已在多个卵巢早衰人群中被证实与原发性或继发性闭经有关。人类BMP15基因突变在一对有原发性闭经及卵巢发育不全的意大利姐妹中首次被报道，这一突变导致其蛋白质结构发生改变，分子量增加，从而对野生型BMP15的功能起到负调控作用，影响颗粒细胞生长潜能，抑制孕激素分泌；FIGLA基因位于2号染色体上，与NOBOX一样编码的蛋白也是生殖细胞特异性的转录因子，调节众多卵细胞特异性基因的表达，这些基因在卵泡发育及透明带形成中都扮演着重要角色，其有一个经典的结合元件即E-box(CANNTG)，其主要通过与另一个转录因子TCF3(transcriptionfactor3[MIM147141])形成异二聚体发挥功能。Figla基因敲除的小鼠出现窦前卵泡形成障碍，并且在出生后卵子迅速耗竭，因此FIGLA基因也是卵巢早衰的重要候选基因之一，目前已有研究者在100例汉族卵巢早衰病例中筛查到2名患者携带FIGLA基因突变，而与其匹配的300例对照组中并无该基因突变，表明FIGLA基因突变在中国POF人群中并不罕见。中国卵巢早衰患者人群中，广泛存在FMR1、FOXL2、FSHR、POF1B、INHA、NOBOX、GDF9、BMP15、FIGLA基因的基因突变，从而导致发生卵巢早衰。临床研究显示，FMR1基因5’端非翻译区包括一段数目可变的CGG重复序列，正常人群中其重复数一般不大于40，而55-199个重复数均可导致FMR1基因功能异常从而引起卵巢早衰，在高加索人群中由于FMR1基因上游CGG序列重复数变异导致的卵巢早衰在散发人群中占3.3％–6.7％，而在家族性卵巢早衰中占13％，中国人群中目前尚无具体数据。目前在BPES患者中，已有多种FOXL2基因突变型被鉴定，其中最常见的是基因内突变(约占71％)，随之而来的是若干种基因型与表型之间关系的明确，有研究对其总结发现导致蛋白翻译提前终止于FOXL2蛋白的poly-Ala束之前的基因突变与I型BPES发生有关，然而导致蛋白翻译延长的基因突变则多引起II型BPES。从1996年开始便陆续有学者报道FSHR基因突变与POF发病之间的关联，其中最早报道的是在6个芬兰的POF家系中发现的错义突变C566T，其后Beau等又报道了同时携带FSHR第六外显子上Ile160Thr突变以及第十外显子上Arg573Cys突变的复合杂合突变的POF散发病例，近年来如下错义突变纷纷被证实与POF发病有关，如：Asp224Val、Leu601Val、Ala419Thr、Pro348Arg、Pro519Thr、Ala307Thr以及Ser680Asn等。POF1B基因位于X染色体上与卵巢正常功能维持密切相关的一个区域内，能逃逸X染色体失活，最早是在一个由于X染色体与1号染色体易位导致其第三内含子出现断裂而出现POF表型的病人中被确定为POF候选基因，后有研究者在一个黎巴嫩POF家系中确定了在POF1B基因第10个外显子第1123处G→A的点突变作为POF的病因，其主要影响POF1B蛋白与actin的结合而影响卵子发育。有多个研究显示INHAG769A突变与卵巢早衰发病相关，随之又有研究者报道了在斯洛维尼亚及新西兰人群中–16C>T(rs35118453)与–124A>G(rs11893842)两个单核苷酸多态性与POF发病相关。NOBOX基因是一个重要的卵细胞特异性转录因子，有研究者对200个中国POF患者中该基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卵巢早衰相关基因全外显子扩增及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从检测材料中提取基因组DNA；/n(2)利用SEQ ID NO：1～120共120条引物，针对FMR1、FOXL2、FSHR、POF1B、INHA、NOBOX、GDF9、BMP15、FIGLA共9个基因全部外显子进行扩增试验；扩增试验及阴性对照共计61个PCR反应是同步进行的，所述120条引物的Tm值范围为57～62℃；/n(3)采用琼脂糖电泳和凝胶成像系统对扩增产物进行检测；/n(4)使用自动测序仪对扩增产物的测序结果进行分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种卵巢早衰相关基因全外显子扩增及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从检测材料中提取基因组DNA；
(2)利用SEQIDNO：1～120共120条引物，针对FMR1、FOXL2、FSHR、POF1B、INHA、NOBOX、GDF9、BMP15、FIGLA共9个基因全部外显子进行扩增试验；扩增试验及阴性对照共计61个PCR反应是同步进行的，所述120条引物的Tm值范围为57～62℃；
(3)采用琼脂糖电泳和凝胶成像系统对扩增产物进行检测；
(4)使用自动测序仪对扩增产物的测序结果进行分析。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张丹，黄荷凤，张润驹，李静怡，刘益枫，陈松长，徐谷峰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33