重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种重组塔宾曲霉单宁酶，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列构成。本发明专利技术还公开了编码该单宁酶的基因，含有该基因的表达载体、重组菌株；制备该单宁酶的方法以及该单宁酶的应用。根据本发明专利技术的实施例的重组塔宾曲霉单宁酶具有显著大于现有单宁酶的活性及热稳定性；根据本发明专利技术实施例的制备方法具有较高的单宁酶产率；根据本发明专利技术实施例的单宁酶能工业化量产没食子酸。

Expression and application of recombinant tannase from Aspergillus tabens

The invention provides a recombinant tannase of Aspergillus tabens, which is composed of amino acid sequence of SEQ ID No: 1. The invention also discloses a gene encoding the tannase, an expression vector containing the gene, a recombinant strain, a method for preparing the tannase and an application of the tannase. According to the embodiment of the invention, the recombinant tannase of Aspergillus tabuinus has significantly higher activity and thermal stability than the existing tannase; according to the embodiment of the invention, the preparation method has higher tannase yield; according to the embodiment of the invention, the tannase can produce gallic acid in industrial quantities.

【技术实现步骤摘要】
重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及重组塔宾曲霉单宁酶及其表达和应用。
技术介绍
单宁酶，又称单宁酰基水解酶(tanninacylhydrolase，TAH，EC.3.1.1.20)，是一种用途广泛的生物催化剂，在生物转化中发挥重要的作用，在食品、污水处理、制革、制药，尤其是茶饮料处理方面具有广泛的应用价值，能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，解除单宁络合蛋白的效果。此外，FDA(美国食品及药品管理局)已经公布单宁酶为安全食品，同时日本也允许单宁酶应用于食品制造业。因此，近年来对单宁酶的研究备受关注，具有广阔的应用前景。目前，工业化单宁酶的生产主要通过传统固态发酵和液态发酵两种方法，相比于液态发酵，固态基质中水不溶性成分高，为微生物尤其是丝状真菌提供了良好的附着位点，微生物生长环境良好，酶产量高且酶系丰富。但固态发酵存在一些不可避免的缺点，例如发酵过程中产生过多次级代谢产物，为后期纯化带来困难。基于此，利用毕赤酵母异源表达单宁酶可有效解决上述问题；与单宁酶发酵方式相比，利用异源表达系统生产单宁酶具有产量高、成本低、操作技术成熟、遗传背景清楚等优点。此外，构建异源表达载体时，利用高效强启动子对重组蛋白进行高效表达，能降低背景表达量，同时也可利用纯化标签(如His标签)解决纯化难题。因此，相比于传统发酵方式，利用异源表达系统进行外源蛋白的表达具有强大的优势。然而，目前生产的单宁酶的酶活仍然较低，热稳定性也较差，无法用于工业化量产没食子酸。因而现有的单宁酶生产技术仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的第一个目的在于提出一种重组塔宾曲霉单宁酶。本专利技术的第二个目的是提出一种重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。本专利技术的第三个目的是提出一种表达载体。本专利技术的第四个目的是提出一种重组菌株。本专利技术的第五个目的是提出一种制备重组塔宾曲霉单宁酶的方法。本专利技术的第六个目的是提出重组塔宾曲霉单宁酶的用途。在本专利技术的第一个方面中，根据本专利技术实施例，提供了一种重组塔宾曲霉单宁酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。其中，该酶包括574个氨基酸。根据本专利技术实施例的重组塔宾曲霉单宁酶，其具有较高的酶促活性，酶活为296.9U/mL，以及较好的热稳定性。另外，在本专利技术的第二方面中，根据本专利技术实施例，提供一种重组塔宾曲霉单宁酶编码基因，其编码上述的重组塔宾曲霉单宁酶，且其包含下列核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术基于PCR的方法分离克隆了塔宾曲霉单宁酶基因，DNA全序列分析结果表明，重组塔宾曲霉单宁酶基因全长1725bp。在本专利技术的第三方面中，根据本专利技术实施例，提供了一种表达载体，其包含上述重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。在本专利技术的第四方面中，根据本专利技术实施例，提供了一种重组菌株，其包含上述重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。在本专利技术的第五方面中，根据本专利技术实施例，提供了一种制备重组塔宾曲霉单宁酶的方法，其包括下列步骤：S1、用上述的表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；S2、培养重组菌株，诱导表达出重组塔宾曲霉单宁酶。根据本专利技术的进一步实施例，所述步骤S1包括：S11、构建表达载体pPIC9K-Tan；S12、将表达载体pPIC9K-Tan线性化；S13、将线性化的表达载体pPIC9K-Tan通过电击转化法转化至毕赤酵母感受态细胞内；S14、将步骤S13获得的毕赤酵母感受态细胞利用G418抗性筛选，得重组菌株。根据本专利技术的进一步实施例，所述步骤S2中诱导重组塔宾曲霉单宁酶表达采用甲醇诱导罐进行诱导表达，所述甲醇诱导罐诱导表达包括：甘油分批发酵阶段、饥饿阶段及甲醇流加阶段。根据本专利技术实施例，本专利技术通过设计了一对特异引物，将编码塔宾曲霉单宁酶成熟蛋白(其编码的氨基酸序列表如SEQIDNO：1所示)的核苷酸序列(如SEQIDNO：2所示)用PCR方法从塔宾曲霉基因中扩增出来，克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K，构建表达载体pPIC9K-Tan，采用电击转化毕赤酵母GS115获得重组菌株，经甲醇发酵诱导表达出酶活高和热稳定好的重组塔宾曲霉单宁酶。在本专利技术的第六方面中，根据本专利技术实施例，本专利技术还提出了上述重组塔宾曲霉单宁酶在没食子酸生产中的应用，将上述重组塔宾曲霉单宁酶用在五倍子单宁酸提取过程中进行酶法处理，生产没食子酸，相对于酸法来说，更加环保、省时、节能。根据本专利技术的进一步实施例，生产没食子酸包括：取5g粉碎后的五倍子置于烧杯中，加入250mL蒸馏水，调pH至6.5-7.0，而后加入重组单宁酶粗酶液，维持pH至6.5-7.0，于50℃水浴浸提75min，得没食子酸。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为提取塔宾曲霉基因组结果；图2为从塔宾曲霉基因中PCR扩增的单宁酶基因结果；1：PCR扩增的单宁酶基因；M：1kbDNAmaeker；图3是重组克隆质粒pMD19T-Tan；图4是线性化表达载体pPIC9K-Tan；图5是线性化表达载体pPIC9K-Tan鉴定电泳结果；图6是整合了表达载体pPIC9K-Tan的重组毕赤酵母GS115菌株PCR鉴定电泳结果a：特异性引物验证；b：通用引物验证；图7是重组毕赤酵母GS115菌株经甲醇诱导表达产重组塔宾曲霉单宁酶曲线图；图8是重组塔宾曲霉单宁酶的最适反应温度曲线；图9是重组塔宾曲霉单宁酶的50℃和60℃的热稳定性曲线图；图10是重组塔宾曲霉单宁酶的70℃的热稳定性曲线图；图11是重组塔宾曲霉单宁酶的最适pH曲线图；图12是重组塔宾曲霉单宁酶的酸碱稳定性曲线图；图13是酸法提取没食子酸曲线图；图14是重组塔宾曲霉单宁酶酶法提取没食子酸曲线图；图15是料液比对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；图16是加酶量对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；图17是pH对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；图18是温度对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；图19是提取时间对酶法提取五倍子单宁转化没食子酸的影响；图20是单宁酶Ao-Tan的最适反应温度曲线；图21是单宁酶Ao-Tan的热稳定曲线；图22是单宁酶Ao-Tan的最适pH曲线；图23是单宁酶Ao-Tan的酸碱稳定曲线。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。下文的公开提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组塔宾曲霉单宁酶，其特征在于，其氨基酸系列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组塔宾曲霉单宁酶，其特征在于，其氨基酸系列如SEQIDNO：1所示。


2.一种重组塔宾曲霉单宁酶编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的重组塔宾曲霉单宁酶。


3.如权利要求2所述的重组塔宾曲霉单宁酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


4.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。


5.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述的重组塔宾曲霉单宁酶编码基因。


6.一种制备重组塔宾曲霉单宁酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、用权利要求4的表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；
S2、培养重组菌株，诱导表达出重组塔宾曲霉单宁酶。


7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
S...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖安风，邵嫄，茹毅，张永辉，翁惠芬，杨秋明，肖琼，陈艳红，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35