烟曲霉单宁酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟曲霉单宁酶突变体。所述突变位点为Kex2蛋白酶切割位点K315‑R316。本发明专利技术通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶位点K315‑R316对酶性质的影响分析，明确该位点对于酶的催化效率和稳定性影响较大，双点的缺失突变AfTanΔKR单宁酶表现出更加优良的酶学特性，具有在食品工业中发挥巨大作用的潜力。

Tannase mutant of Aspergillus fumigatus and its application

The invention discloses a tannase mutant of Aspergillus fumigatus. The mutation site is Kex2 protease cleavage site k315 \u2011 r316. The invention analyzes the influence of k315 \u2011 r316, a Kex2 protease site in aftana, on the properties of the enzyme, and it is clear that the site has a great influence on the catalytic efficiency and stability of the enzyme. The two-point deletion mutation aftan \u0394 Kr tannase shows better enzymological characteristics, and has the potential to play a huge role in the food industry.

【技术实现步骤摘要】
烟曲霉单宁酶突变体及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种烟曲霉单宁酶突变体及其在柿子汁加工中的应用。
技术介绍
单宁酶(TannaseEC3.1.1.20)是可将单宁中的酯键与缩酚羧键断裂，生成葡萄糖和没食子酸等物质的一类酶的总称，在速溶茶、葡萄酒和啤酒等食品加工领域具有巨大的应用潜力。尽管人们对单宁酶的研究具有广泛兴趣和较长的历史，到目前为止，人们对单宁酶的研究主要集中在产酶微生物的筛选及产酶特性分析方面，仅有数个单宁酶基因被克隆并表达，涉及的微生物有米曲霉，黑曲霉、植物乳杆菌等。毕赤酵母作为优良的表达宿主，上百种酶基因已经在毕赤酵母中进行了高效表达。单宁酶基因富含二硫键、且以多聚体和高子量等特征，这使得单宁酶基因个克隆和表达具有较强的复杂性，探究影响单宁酶在毕赤酵母中因素意义重大。专利技术人所在课题组前期从从浓香大曲中筛选获得产单宁酶嗜热真菌(A.fumigatusHBHF5)，该菌类种属条件致病菌，具有一定潜在的安全风险。为此，将该菌株中的单宁酶基因(afTanA)在P.pastorisGS115中进行了高效表达。检测发现毕赤酵母表达的重组单宁酶(AfTanA)由2个30kD左右大小亚基组成，且酶的稳定性降低，推测这些性质的改变与Kex2蛋白酶作用相关。单宁酶中普遍含有1-2个Kex2位点，AfTanA单宁酶中Kex2位点对酶学特性影响还不清楚。因此，亟待深入开展Kex2位点对单宁酶AfTanA性质影响的研究工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟曲霉单宁酶突变体，探讨Kex2蛋白酶酶切位点对该酶的pH稳定性、耐热稳定性及在柿子汁加工应用效果的影响，为单宁酶的生产及性能改造提供理论指导。一种烟曲霉单宁酶突变体，所述突变位点为Kex2蛋白酶切割位点K315-R316。含上述烟曲霉单宁酶突变体的基因的载体。含上述烟曲霉单宁酶突变体基因载体的工程菌。扩增上述的烟曲霉单宁酶突变体的基因中任一片段的引物。上述烟曲霉单宁酶突变体在提高柿子汁抗氧化中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶位点(K315-R316)对酶性质的影响分析，明确该位点对于酶的催化效率和稳定性影响较大，双点的缺失突变AfTanΔKR单宁酶表现出更加优良的酶学特性，具有在食品工业中发挥巨大作用的潜力。附图说明图1为使用I-TASSER构建的AfTanA分子模型及Kex2位点分析。图2为单宁酶AfTanA及其突变体的SDS-PAGE电泳比较分析。图3为单宁酶突变体的酶学性质比较分析。图4为柿汁水解前后多酚类物质含量分析。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。下述实施例所用材料与试剂：pMDTM19T-afTanA质粒由本课题组构建并提供、巴斯德毕赤酵母GS115菌株和pPIC9k质粒购自Invitrogen公司；FastPfuDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，T4DNA连接酶、限制性内切酶SpeI，NotI和SalI购自大连宝生物有限公司。没食子酸丙酯(PG)购自浙江匝海化工试剂厂，罗丹宁购自上海生物工程有限公司，单宁酸购自上海化学试剂公司，其它化学试剂为进口或国产分析纯。LB，YPD，MD，BMGY和BMMY培养基参照Invitrogen公司Multi-CopyPichiaExpressionKit)操作手册配制。实施例1AfTanA中Kex2酶切位点及其作用分析分析使用蛋白质在线建模软件I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)构建AfTanA突变体的三维结构模，通过PyMOL软件进行蛋白结构分析。使用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Kex2位点氨基酸序列比对分析。使用NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)软件预测N-糖基化位点。该酶由一个具有典型的ɑ/β丝氨酸水解酶结构区域和盖子结构域所组成，虽然该酶属于单宁酶家族中的阿魏酸脂酶，这使得该晶体结构还无法完全提供充足真菌来源单宁酶的结构信息，但是对真菌单宁酶的分子机制提供了一定的借鉴。经对多个单宁酶序列比对分析发现，位于盖子结构区域中的LoopFK中的K315R316位点氨基酸普遍存在单宁酶中(如图1)。不同来源的单宁酶在该区域中表现出较强的趋异进化，其中米曲霉单宁酶(ABJ51876.1)差异最大，除在该区域有两个连续的Kex2酶切位点外，同时还有较长的Loop结构，这表明AfTan中的Kex2位点对酶的影响很可能与之有明显差异。实施例2：Kex2突变体的构建引物的设计与合成：参照前期获得的单宁酶afTanA基因序列信息(XP_746534.1)，依据FastMultiSiteMutagenesisSystem要求设计单宁酶afTanA中Kex2位点突变引物，如表1所示，突变引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。表1试验所用引物以pMDTM19T-afTanA质粒为模板，PCR反应参数：95℃5min；95℃30s,55℃30s,72℃4min,25个循环；72℃10min。参照FastMultiSiteMutagenesisSystem说明书进行单宁酶afTanA基因Kex2位点的定点突变，分别构建pMDTM19T-afTanR316A和pMDTM19T-afTanΔKR突变质粒，将阳性克隆子送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。分别将pMDTM19T-afTanR316A、pMDTM19T-afTanΔKR和pPIC-9k质粒进行双酶切，利用胶回收试剂盒对目的酶切产物进行回收，进行afTanA和pPIC-9k的连接反应，分别构建表达质粒pPIC9k-afTanR316A和pPIC9k-afTanΔKR。采用5’AOX和3’AOX通用引物对转化子进行验证，将筛选重组表达质粒阳性转化子进行测序鉴定。测序正确的pPIC9k-afTanR316A和pPIC9k-afTanΔKR质粒经SalI将表达质粒进行线性化处理后，电转化至P.pastorisGS115感受态细胞中，利用酶活性筛选方法对转化子进行筛选，获得阳性转化子。实施例3：诱导表达及SDS-PAGE分析挑取单阳性转化子至50mLYPD培养基中，30℃，250rmp培养12h。以1％的接种量接种于200mLBMGY中，在摇床中30℃，250-300rpm生长至OD600＝2-6(约16-18小时)，室温8000g离心5min收集细胞，去除上清，100mLBMMY重悬细胞，放入摇床继续培养至48h，维持甲醇终浓度为0.5％，离心收集发酵液，即为粗酶液，进行活力测定及SDS-PAGE分析。将含重组菌株进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟曲霉单宁酶突变体，其特征在于，所述突变位点为Kex2蛋白酶切割位点K315-R316。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟曲霉单宁酶突变体，其特征在于，所述突变位点为Kex2蛋白酶切割位点K315-R316。


2.一种含权利要求1所述烟曲霉单宁酶突变体的基因的载体。


3.含有权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢海强，谷新晰，陈伟，陈宝江，谷子林，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13