通过调控细胞壁组成蛋白构建的低产高级醇酿酒酵母菌株制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种通过调控细胞壁组成蛋白合成构建的低产高级醇的酿酒酵母菌株及其应用。本发明专利技术为了解决酿酒酵母在啤酒生产中合成过多高级醇的问题，通过调控酿酒酵母细胞壁组成蛋白的合成，构建一种低产高级醇的酿酒酵母菌株，能够在保持良好发酵性能的前提下，达到了低产高级醇的效果，为酿造风味良好、口感独特的小麦啤酒奠定了理论基础。

Construction of Saccharomyces cerevisiae strains with low production of higher alcohols by regulating cell wall components

The invention belongs to the field of bioengineering technology and relates to the breeding of industrial microorganisms, in particular to a Saccharomyces cerevisiae strain with low yield and high alcohol constructed by regulating the synthesis of cell wall component protein and its application. In order to solve the problem of too many higher alcohols synthesized by Saccharomyces cerevisiae in beer production, the invention constructs a Saccharomyces cerevisiae strain with low production of higher alcohols by regulating the synthesis of cell wall component protein of Saccharomyces cerevisiae, which can achieve the effect of low production of higher alcohols on the premise of maintaining good fermentation performance, and lays a theoretical foundation for brewing wheat beer with good flavor and unique taste \u3002

【技术实现步骤摘要】
通过调控细胞壁组成蛋白构建的低产高级醇酿酒酵母菌株
：本专利技术属于生物工程
，涉及工业微生物的育种，尤其是一种通过调控细胞壁组成蛋白合成构建的低产高级醇的酿酒酵母菌株及其应用。
技术介绍
：高级醇是啤酒酿造过程中，酿酒酵母产生的主要风味代谢产物之一。高级醇，俗称杂醇油，是指具有3个及3个以上碳链骨架的一类醇的统称，是形成啤酒风味和口感的重要的化学物质之一。啤酒中的高级醇类物质主要有正丙醇、正丁醇、2-甲基-1-丙醇(异丁醇)、3-甲基-1-丁醇(异戊醇)、2-甲基-1-丁醇(活性戊醇)、2-苯乙醇、色醇、对羟基苯乙醇(酪醇)等。适量的高级醇具有使啤酒口感协调、酒体丰满的作用，但高级醇含量过高，会导致啤酒形成异杂味，不仅影响啤酒的饮用口感和风味质量，而且饮用后还会产生口渴、头痛等症状，对饮用者的身体产生明显的副作用，不利于饮用者的身体健康。成品啤酒中80％左右的高级醇是在啤酒主发酵阶段由酵母的生长和繁殖活动所产生的。酿酒酵母吸收麦芽汁中游离的氨基酸，并利用氨基酸中的氨基合成自身生长繁殖所需的蛋白质。当氨基酸中的氨基被利用后，剩下的α-酮酸经过一系列的非可逆性反应最后生成一种代谢副产物，即为高级醇。这一代谢途径最初是由德国化学家费利克斯·埃尔利希(FelixEhrlish)于1904年提出的，因此也被称为埃尔利希途径(Ehrlishpathway)，即分解代谢途径。此后，哈里斯研究糖代谢时发现，葡萄糖经EMP途径生成的代谢产物-丙酮酸，经系列反应后可以生成α-酮酸，因此在1953年提出了高级醇的合成代谢途径，也被称为哈里斯途径(Harrispathway)。综上所述，酿酒酵母合成高级醇的代谢途径主要有两条：一条是α-酮酸分解代谢途径，即氨基酸分解代谢途径；另一条为α-酮酸合成代谢途径，即高级醇合成代谢途径。高级醇主要由酿酒酵母的代谢活动所产生的，在啤酒发酵过程中受酵母菌株和发酵原料组成、发酵工艺条件等外界条件的共同影响。酵母菌株对高级醇生成的影响，主要体现在酵母菌种类型和酵母细胞所处的生理状态。因为高级醇的生成与酵母菌株合成蛋白质的生命活动密切相关，在诸多影响高级醇生成的因素中，酵母菌株起着决定性的作用。一般来说，粉末性酵母比凝聚性酵母的高级醇生成量要高；同化率强、发酵度高的菌株倾向于形成更高浓度的高级醇。发酵原料是酵母生长繁殖、代谢发酵的营养基质，为酵母提供碳源、氮源、无机元素等所需的营养物质；而发酵原料的种类和配比决定着酵母的代谢反应，进而影响酵母在生长、繁殖过程中所产生的代谢产物，这些代谢产物的种类和浓度决定了成品啤酒的口感和风格。小麦芽、小麦、大米等含有丰富蛋白质的原料，在提高啤酒泡持性的同时也会提高啤酒中高级醇的含量。玉米、高粱、蔗糖和淀粉糖浆等含有可溶性氮很少的辅料，会降低麦芽汁的总氮含量，进而有利于降低高级醇的含量。发酵工艺对高级醇形成的影响，主要体现在发酵温度、麦芽汁充氧水平、麦芽汁pH值、发酵压力等方面。对发酵温度而言，发酵前期温度较高时，酵母代谢活性强、增殖速度快，酒液对流加剧，有利于高级醇生成，而较低的发酵温度对高级醇的产生有明显抑制作用。发酵温度为28℃时，高级醇的生成速度最大；20℃时，有最高的高级醇生成量。麦汁中的含氧量越高，酵母传代次数越多，形成高级醇的量将越多，反之则越少。麦芽汁充氧水平高于9mg/L，或采用纯氧通气，在发酵中通气搅拌，均会导致高级醇的增加，正丙醇增加最为剧烈。加压发酵，酵母繁殖代数减少、发酵速度减缓，高级醇的合成量则会降低。针对啤酒中高级醇含量高的问题，科研工作者已采取多种措施来解决此问题。王国正等利用常温常压等离子体诱变技术得到一株高级醇生成量比亲本菌株降低了20％的酿酒酵母菌株；蔡洋等对经过航空诱变的上面发酵酵母303进行分离筛选得到1株性能优良的低产高级醇的上面发酵啤酒酵母；袁仲等将低能氮离子注入和超高压处理技术结合，获得一株高级醇合成量适宜的优质全小麦酿酒酵母。近年来，有许多关于酿酒酵母高级醇代谢基因改造的研究报道。Park等以亮氨酸营养缺陷型LEU2基因缺失突变株为出发菌株，在敲除ALD6、BAT1基因的基础上过表达基因ILV2、ILV3、ILV5、ARO10、ADH2、LEU2、LEU3、LEU4，构建的突变株异戊醇的生成量较出发菌株提高了34倍。Chen等研究发现通过同时过表达酿酒酵母缬氨酸代谢途径中的ILV2、ILV3、ILV5、BAT2基因可以提高异丁醇的生产量，而在此突变株的基础上过表达ILV6基因反而会降低异丁醇的生成量。张翠英等构建的BAT2部分缺失、ATF1过表达的酿酒酵母突变株，其高级醇的生成量分别比出发菌株降低了51％。所有这些大多是围绕下面发酵酵母进行的，而针对小麦啤酒所用的上面发酵酵母高级醇代谢相关基因的改造与育种却鲜有报道。小麦啤酒以小麦芽为原料，采用上面发酵法酿制的啤酒，具有小麦芽特有的香气、细腻洁白的泡沫、浓郁醇厚的口感、强烈的杀口力等显著的风味特点。同时，小麦麦芽与大麦麦芽相比，具有以下优势：(1)小麦是第二大粮食作物，产量仅次于玉米，且种植地域广、价格便宜；(2)小麦麦芽淀粉含量高，浸出率高达83-85％；比大麦麦芽高出3至5个百分点，有利于降低生产成本；(3)小麦麦芽的粗、细粉差偏高，蛋白溶解度偏高，能赋予成品啤酒丰富细腻的泡沫，提高泡持性；(4)小麦芽中的α-淀粉酶等酶类含量高、活力强，有利于缩短液化、糖化时间，提高可发酵性糖的含量；(5)小麦芽花色苷含量低，利于啤酒的非生物稳定性，对降低口感涩味也有利。小麦啤酒由于其较高的发酵温度以及原料中丰富的蛋白质含量导致成品酒中高级醇含量高达300mg/L以上，而普通大麦啤酒的高级醇含量一般在100mg/L以下。较高的高级醇含量将导致饮用后产生口渴、头痛等症状，不利于饮用者的身体健康，严重制约了小麦啤酒的发展，因此选育低产高级醇的酿酒酵母对小麦啤酒的发展至关重要。
技术实现思路
：本专利技术的目的是解决酿酒酵母在啤酒生产中合成过多高级醇的问题，通过调控酿酒酵母细胞壁组成蛋白的合成，构建一种低产高级醇的酿酒酵母菌株。为解决上述技术问题，本专利技术技术方案如下：本专利技术提供一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，是通过敲除酿酒酵母宿主细胞中的GPI-锚定蛋白基因构建的；进一步地，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR1，其GeneID为：856729，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQIDNO:1所示；进一步地，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR3，其GeneID为：854804，核苷酸序列见核苷酸序列表中SEQIDNO:2所示；进一步地，所述敲除为单敲除或双敲除；优选地，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S17，编号CICC1929；更优选地，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S17-Δtir1-k-p，是通过单敲除酿酒酵母S17中的TIR1基因获得的；更优选地，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomycesc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，是通过敲除酿酒酵母宿主细胞中的GPI-锚定蛋白基因构建的。/n

【技术特征摘要】
1.一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，是通过敲除酿酒酵母宿主细胞中的GPI-锚定蛋白基因构建的。


2.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述GPI-锚定蛋白基因为单敲除或双敲除。


3.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR1，GeneID为：856729，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQIDNO:1所示。


4.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR3，其GeneID为：854804，核苷酸序列见核苷酸序列表中SEQIDNO:2所示。


5.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S17，编号CICC1929。


6.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S17-Δtir1-k-p，是通过单敲除酿酒酵母S17中的TIR1基因获得的。


7.如权利要求1所述的一种低...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖冬光，孙中贯，胡智慧，张翠英，陈叶福，杜丽平，郭学武，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12