萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用制造技术

本发明专利技术涉及代谢工程领域，具体涉及萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用。同时，本发明专利技术还进一步提供了一种重组酵母菌，可以高产量、高纯度地一步合成橙花叔醇，在SC‑Trp培养基中实时产生橙花叔醇可达约57.8μg/h/L，为生物合成生产橙花叔醇提供理论与技术支持。

Application of terpene synthase gene ghtps14 in the synthesis of Neroli tertiary alcohol

The invention relates to the field of metabolism engineering, in particular to the application of terpene synthase gene ghtps14 in the synthesis of Neroli tertiary alcohol. At the same time, the invention further provides a recombinant yeast, which can synthesize Neroli TERT alcohol in one step with high yield and purity. The real-time production of Neroli TERT alcohol in SC \u2011 Trp medium can reach about 57.8 \u03bc g / h / L, providing theoretical and technical support for the production of Neroli TERT alcohol by biosynthesis.

【技术实现步骤摘要】
萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用
本专利技术涉及代谢工程领域，具体涉及萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用。
技术介绍
橙花叔醇(nerolidol)是虫害诱导植物挥发物组分萜烯同系物DMNT合成的前体。萜烯同系物不仅是花香气味的主要成分，也是虫害诱导的植物挥发物的重要组分，它既可以吸引传粉昆虫为植物传粉也可以吸引植食性害虫的捕食性或寄生性天敌抵御植食性害虫的为害，在植物与昆虫间的“信息网”交流中发挥着重要作用。然而仅转化直接催化DMNT生成的CYP82L基因的烟草由于缺少合成橙花叔醇的代谢通路而最终不能生成DMNT，但在含有萜烯同系物代谢通路的植物中通过超表达DMNT合成前体橙花叔醇基因可以大大提高DMNT的释放量，比如超表达橙花叔醇合酶基因的水稻，其橙花叔醇和DMNT的释放量均显著升高。另外，蚜虫报警信息素组分(E)-β-法尼烯最简便有效地化学合成方法就是以橙花叔醇为底物通过水解合成的。由此可见，通过合成生物学技术手段生成橙花叔醇具有重要应用前景。而现有技术中在利用合成生物学技术手段合成橙花叔醇时，往往难以生成高纯度的产物，为后续分离造成很大的难度。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决上述问题，本专利技术提供了萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用。(二)技术方案本专利技术首先提供萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。作为优选，所述萜烯合酶基因GhTPS14的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术发现，来源于陆地棉的萜烯合酶基因GhTPS14可以高产量、高纯度地合成橙花叔醇产物。本专利技术进一步提供一种重组酵母菌，将萜烯合酶基因GhTPS14构建至酵母菌后制得，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术进一步提供制备所述重组酵母菌的方法，将所述萜烯合酶基因GhTPS14转化至所述酵母菌时，所用的酵母表达载体为pESC-Trp。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述重组酵母菌为pESC-Trp-GhTPS14-WAT11，将含萜烯合酶基因GhTPS14的重组酵母载体转化至酵母菌WAT11后制得。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述重组酵母菌为pESC-Trp-GhTPS14-INVSc1，将含萜烯合酶基因GhTPS14的重组酵母载体转化至酵母菌INVSc1后制得。本专利技术进一步提供所述重组酵母菌在合成橙花叔醇方面的应用。作为优选，将所述重组酵母菌在含半乳糖的SC-T诱导培养基中诱导培养。作为优选，在所述诱导培养前，将所述重组酵母菌在缺失Trp的SC-T液体培养基中，在28～30℃(优选29.5℃)，250～270rpm(优选260rpm)条件下培养至OD600为0.9～1.1(约24h)。作为优选，在所述诱导培养后，取5mL培养产物加入内标癸酸乙酯用于橙花叔醇的检测及精确定量。(三)有益效果(1)本专利技术提供了萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用，在转入酵母菌后，可以一步生成高纯度的橙花叔醇，为生物合成生产橙花叔醇提供理论与技术支持。(2)本专利技术进一步提供了一种重组酵母菌，可以高产量、高纯度地合成橙花叔醇，在SC-Trp培养基中产生橙花叔醇可达约57.8μg/h/L。附图说明图1为GC-MS检测橙花叔醇的释放；其中：A，橙花叔醇(nerolidol)标准品和含不同酵母表达载体的酵母菌株WAT11中橙花叔醇的释放；B，橙花叔醇(nerolidol)标准品和含不同酵母表达载体的酵母菌株INVSc1中橙花叔醇的释放；C，橙花叔醇质谱图。IS，Internalstandard，内标。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。橙花叔醇的检测：气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测，仪器：岛津气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP2030)。分析条件：GC条件：色谱柱为Rtx-5MS(0.25μm×0.25mm×30m)。载气为氦气，不分流进样，进样口流速为3mL/min，柱流量为1mL/min。进样口温度为250℃。升温程序为40℃保持1min，以4℃/min升到130℃，保持5min，以10℃/min升到250℃，保持5min。MS条件：离子源温度和传输线温度均为250℃，EI70ev，载气为氦气，质谱扫描速度为1000amu/s，扫描范围为50-650m/z。内标癸酸乙酯标准品的配制：取10μL癸酸乙酯标准品于90μL正己烷混合均匀得到10-1癸酸乙酯，按此方法依次稀释得到10-4癸酸乙酯标准品。取10μL10-4癸酸乙酯标准品用于试验以进行产物的定量计算。实施例1重组酵母菌株pESC-Trp-GhTPS14-WAT11的构建收集绿盲蝽取食为害的陆地棉叶片，提取RNA，反转录得到cDNA作为PCR扩增目的片段的模板。所用引物为F(序列如SEQIDNO.3所示)和R(序列如SEQIDNO.4所示)：F：ATGCAAATGGGACTTTCR：CTAGTTTGATCTGATATTTAGAG胶回收目的片段，将之克隆至大肠杆菌Trans1T1中。以得到的含有目的片段序列的大肠杆菌菌液为模板，以含有载体片段的引物F1(序列如SEQIDNO.5所示)和R1(序列如SEQIDNO.6所示)：F1：ACTATAGGGCCCGGGCGTCGACATGCAAATGGGACTTTCR1：ATCTTAGCTAGCCGCGGTACCCTAGTTTGATCTGATATTTAGAG其中划线部分分别为SalI和KpnI酶切位点，进行PCR扩增。胶回收扩增产物，与SalI和KpnI双酶切的pESC-Trp载体胶回收产物进行连接，转化至大肠杆菌Trans1T1培养，得到含目的片段的重组质粒pESC-Trp-GhTPS14。将重组质粒转化至酵母WAT11(Urban,P.,Mignotte,C.,Kazmaier,M.,Delorme,F.andPompon,D.(1997)Cloning,yeastexpression,andcharacterizationofthecouplingoftwodistantlyrelatedArabidopsisthalianaNADPH-cytochromeP450reductaseswithP450CYP73A5.J.Biol.Chem.272,19176–19186.)感受态细胞于缺失Trp的SC-T固体培养基培养，得到含pESC-Trp-GhTPS14的重组酵母WAT11菌株单克隆。实施例2重组酵母菌株发酵生产橙花叔醇及其检测分别接种含pESC-Trp的重组酵母WAT11菌株单克隆和pESC-Trp-GhTPS14的重组酵母WAT11菌株单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述萜烯合酶基因GhTPS14的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种重组酵母菌，其特征在于，将萜烯合酶基因GhTPS14构建至酵母菌后制得，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


4.制备权利要求3所述的重组酵母菌的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永军，刘丹凤，寇俊凤，黄欣蒸，张强，孙佩瑶，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11