精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法制造技术

本发明专利技术属于基因工程的基因编辑技术领域，更具体地涉及一种高效的基因敲除法，即精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法。本发明专利技术旨在解决目前基因精确敲除中长片段敲除的难度大、周期长的问题。首先确定5’sgRNA靶位点位于起始密码子附近(100bp以内)，3’端sgRNA靶位点位于5’端sgRNA靶位点与终止密码子之间任何位置，sgRNA靶位点的编辑效率分数高并且脱靶效应接近于0；其次确定被删除序列的5’和3’端点位于5’sgRNA靶序列和3’sgRNA靶序列中，修复模板带有终止密码子。最后将5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒与所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板制得显微注射DNA混合液体系一起注入雌雄同体线虫体内，统计其基因编辑效率并验证筛选功能与全基因敲除法的一致性，发现本发明专利技术提供的技术方案基因编辑效率高、性价比好和成功率高的优点。

Precise large fragment gene deletion combined with termination codon insertion

The invention belongs to the technical field of gene editing of gene engineering, and more particularly relates to an efficient gene knock-out method, which is precise large segment gene deletion combined with termination codon insertion. The invention aims to solve the problem of high difficulty and long period in the present gene precise knockout. Firstly, the 5 'sgRNA target site is located near the start codon (within 100bp), and the 3' sgRNA target site is located anywhere between the 5 'sgRNA target site and the stop codon. The editing efficiency fraction of the sgRNA target site is high and the Miss effect is close to 0. Secondly, the 5' and 3 'endpoints of the deleted sequence are located in the 5' sgRNA target sequence and the 3 'sgRNA target sequence. The repair template has the terminal Stop codon. Finally, the 5 'upstream sgRNA plasmid and 3' downstream sgRNA plasmid are injected into the monoecious nematode together with the cas9 plasmid, the co editing marker plasmid, the reporter gene plasmid and the repair template to prepare a microinjection DNA mixture system, and the gene editing efficiency is calculated and the consistency of the screening function and the whole gene knockout method is verified, and the gene editing efficiency of the technical scheme provided by the invention is found The advantages of high rate, good cost performance and high success rate.

【技术实现步骤摘要】
精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法
本专利技术属于基因工程的基因编辑
，更具体地涉及一种高效的基因敲除法，即精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法。
技术介绍
CRISPR/Cas9基因编辑是目前非常高效的基因靶向操作技术之一，具有周期短、安全可靠、成本低等优势，非常适用于构建各种动物模型。通过CRISPR/Cas9系统获得基因敲除效率非常高，目前有以下两种方式：第一种编辑方式是：删除从起始密码子(“ATG”)到终止密码子(“TAG”)之间的完整基因序列，获得全基因删除突变体；第二种编辑方式是：在比较靠近起始密码子的区域用一个sgRNA做基因编辑，随机产生敲入删除突变，从而获得移码突变体。第一种编辑方式的优点是可以保证获得的突变体是完整的敲除突变体，因为全基因序列都被彻底删除(见图1中全基因删除)。缺点是对于基因编码序列(从起始密码子到终止密码子)比较长的基因，比如序列长度是6kb以上的基因，删除大片段的效率比较低，而且筛选难度也比较大。很多情况下在被删除基因的5’端和3’端不一定有合适的sgRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法，其特征在于，包括以下步骤：/n准备Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和雌雄同体线虫；/n确定5’和3’端sgRNA靶位点序列；/n确定和构建修复模板；/n构建5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒；/n配制显微注射DNA混合液：将所述5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒、所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板混合得到所述显微注射DNA混合液；/n显微注射：将所述显微注射DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养得到F1代线虫；以及/n筛选、验证目的突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种精确大片段基因删除结合终止密码子插入的基因敲除法，其特征在于，包括以下步骤：
准备Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和雌雄同体线虫；
确定5’和3’端sgRNA靶位点序列；
确定和构建修复模板；
构建5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒；
配制显微注射DNA混合液：将所述5’端上游sgRNA质粒和3’端下游sgRNA质粒、所述Cas9质粒、共编辑标记质粒、报告基因质粒和修复模板混合得到所述显微注射DNA混合液；
显微注射：将所述显微注射DNA混合液注射入雌雄同体线虫的性腺，得到P0代线虫，培养得到F1代线虫；以及
筛选、验证目的突变。


2.根据权利要求1所述的基因敲除法，其特征在于，所述确定的5’和3’端sgRNA靶位点序列包括以下步骤：
从sgRNA效率预测网站上查找起始密码子附近100bp以内的sgRNA靶位点；选择编辑效率特异性分数高并且脱靶效应低的sgRNA靶位点，即得到所述5’端sgRNA靶位点序列；
从sgRNA效率预测网站上查找在5’端sgRNA靶位点序列与终止密...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵培，康雅虹，罗莹，
申请(专利权)人：福建上源生物科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35