一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法技术

本发明专利技术涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法，属于微生物分离培养技术领域。本发明专利技术以鸡血清替代传统所用的牛、羊、马血清，制备猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其中以5%左右的鸡血清的加入比例效果良好，该培养基价格便宜，来源广泛。用其分离鉴定猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，从56份病料中分离鉴定出猪传染性胸膜肺炎放线杆菌51株，其分离率为97%；而传统的牛血清培养基仅从56份病料中分离鉴定出42株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，其分离率为75%；本发明专利技术的分离鉴定方法具有更高的分离效率。

Culture medium, isolation and identification method and culture method of Actinobacillus pleuropneumoniae

The invention relates to a culture medium, a separation and identification method and a culture method of Actinobacillus pleuropneumoniae, belonging to the technical field of microbial separation and culture. In the invention, the chicken serum is used to replace the traditional bovine, sheep and horse serum to prepare the culture medium of Actinobacillus pleuropneumoniae, in which the addition proportion of about 5% chicken serum is good, the culture medium is cheap and has a wide range of sources. 51 strains of Actinobacillus pleuropneumoniae were isolated and identified from 56 samples, with a separation rate of 97%; while 42 strains of Actinobacillus pleuropneumoniae were isolated and identified from 56 samples by traditional bovine serum culture medium, with a separation rate of 75%; the separation and identification method of the invention has higher separation efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法
本专利技术涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、分离鉴定方法及培养方法，属于微生物分离培养

技术介绍
猪传染性胸膜肺炎(InfectiousPleuropneumoniaofSwine，IPPS)是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的猪的呼吸道疾病，各种年龄猪均可感染。该病是世界范围内的多发病、常见病。我国于1990年首次确认有该病存在，近几年发病率呈上升趋势。该病引起猪只大批量的死亡、生长发育不良，给我过养猪业带来了很大的阻碍，随着养猪业的规模化、集约化发展，该病已经成为严重危害我国养猪业发展的主要呼吸道疾病之一，给我国养猪业带来了严重的经济损失。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)属于巴氏杆菌科、放线杆菌属，是一种革兰氏阴性小球杆菌。根据生长时是否依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称V因子)可将APP分为两个生物型，生物I型(依赖NAD)和生物II型(不依赖NAD)。根据荚膜多糖(CPS)和细菌脂多糖(LPS)，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌被分为15种血清型，且1型和5型分别又分为la、lb亚型和5a、5b亚型，其中1～12型和15型归为生物I型，13型和14型归为生物II型。不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒力有明显差异，所引起的病程也有明显差异。由于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型多达15种，不同血清型菌株之间交叉免疫性又不强，因此灭活苗主要从当地分离的菌株制备而成，且在对疑似猪传染性胸膜肺炎病例的诊治中，细菌分离鉴定也是一种常规有效方法，对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定是确诊猪传染性胸膜肺炎感染的重要依据。传统方法中对该菌的分离鉴定过程中大多数采用在培养平皿中加入牛、马、羊的血清以满足该菌所需要的营养物质，然而这种方法在批量大规模分离鉴定或培养该菌时，成本较高，使用繁琐；并且猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离过程复杂，分离率低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，以解决现有培养基成本较高，取材不便的问题。本专利技术的目的还在于提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，以解决现有分离鉴定的方法过程复杂，应用不便，成本高的问题。本专利技术的目的还在于提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养方法，以解决现有培养方法应用不便，成本高的问题。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基。本专利技术以鸡血清替代传统所用的牛、羊、马血清，制备猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其中以3-7％左右的鸡血清的加入比例效果良好，该培养基价格便宜，来源广泛。进一步的，上述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，还包括质量百分数为0.005-0.015％的烟碱腺嘌呤二核苷酸。由于生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为NAD依赖型，因此以3-7％左右鸡血清和0.005-0.015％NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)左右的比例分离鉴定或培养生物I型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌效果良好。在培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型时，则无需添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。具体的，所述TSA培养基可以为常规的配方，也可以为：每升加入胰蛋白胨13-17g，植物蛋白胨4-6g，氯化钠25-35g，琼脂13-17g，余量为水。优选的，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基包括：体积百分数为5％的鸡血清，余量为TSA培养基。一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：1)病料的采取：取临床症状表现为传染性胸膜肺炎的病猪的肺脏，作为病料；分离培养基制备：所述分离培养基包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基；2)细菌的分离鉴定：将病料接种于分离培养基上，培养至出现单菌落；3)挑选菌形态与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落，然后进行尿素酶试验、CAMP试验和β溶血试验；若单菌落尿酶试验阳性、CAMP试验阳性并且β溶血，则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；若其中任一项不符，则判定为非猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，弃之不用。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌在生长过程中对营养及环境要求较高，TSA培养基营养丰富，对于嗜血菌的培养率非常高，将其引入到猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离培养中，效果较好。同时，本专利技术中在TSA培养基中加入了3-7％的鸡血清对于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行分离，分离效率增高，并且鸡血清价格便宜、来源广泛，分离鉴定成本低。优选的，所述患有传染性胸膜肺炎的病猪为未经用药的患有传染性胸膜肺炎病猪。因该菌与其他杂菌混合感染的时候，细菌的分离更加困难；本专利技术在细菌分离选取未经用药的病猪或濒死猪进行分离，在分离时进行无菌操作，分离率较高，也防止了杂菌的污染。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定传统方法中，一般先根据菌落形态、革兰染色和培养及营养要求进行几个方面进行初步鉴定，然后再根据尿素酶试验阳性，CAMP试验阳性，β溶血，NAD生长依赖，基本鉴定为APP；本专利技术中改良了分离鉴定传统方法中的营养要求部分。优选的，步骤2)中所述培养为在厌氧条件下培养。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为兼性厌氧型菌株，因此，在厌氧条件下进行培养，能够排除好氧的杂菌，具体是在5％CO2厌氧培养容器中进行。具体的，所述TSA培养基可以为常规的配方，也可以为：每升加入胰蛋白胨13-17.0g，植物蛋白胨4-6g，氯化钠25-35g，琼脂13-17g，余量为水。进一步的，将挑选出的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行NAD生长依赖试验，若选出菌落NAD生长依赖，判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型；否则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型。进一步的，还可以对将挑选出的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行卫星生长试验，若选出菌落卫星生长试验阳性，判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型；否则判定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型。优选的，步骤3)中在挑选菌形态与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落时，从形态学特征进行判断。具体是从菌落形态和菌微观形态同时进行判断；所述菌落的形态应为：圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐，并且为透明小菌落或为边缘整齐、灰白色带金黄色、不透明的大菌落。具体的，所述菌微观形态应为：革兰阴性短杆菌，两端钝圆，具有典型的多形性，菌体较小，多为球杆菌，有的成双排列。与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落应符合前述的菌落的形态和菌微观形态。一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的的培养方法，使用含有质量百分数为0.005-0.015％烟碱腺嘌呤二核苷酸的分离培养基培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物I型菌株；所述分离培养基包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基。一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的的培养方法，使用分离培养基培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌生物II型菌株；所述分离培养基包括：体积百分数为3-7％的鸡血清，余量为TSA培养基。...

【技术保护点】
1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，包括：体积百分数为3-7%的鸡血清，余量为TSA培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，包括：体积百分数为3-7%的鸡血清，余量为TSA培养基。


2.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，还包括质量百分数为0.005-0.015%的烟碱腺嘌呤二核苷酸。


3.根据权利要求1或2所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，所述TSA培养基为：每升加入胰蛋白胨13-17g，植物蛋白胨4-6g，氯化钠25-35g，琼脂13-17g，余量为水。


4.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基，其特征在于，包括：体积百分数为5%的鸡血清，余量为TSA培养基。


5.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）病料的采取：取临床症状表现为传染性胸膜肺炎的病猪的肺脏，作为病料；
分离培养基制备：所述分离培养基包括：体积百分数为3-7%的鸡血清，余量为TSA培养基；
2）细菌的分离鉴定：将病料接种于分离培养基上，培养至出现单菌落；
3）挑选菌形态与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌相符的单菌落，然后进行尿素酶试验、CAMP试验和β溶血试验；若单菌落尿酶试验阳性、CAMP试验阳性并且β溶血，则判定为猪传染性胸膜肺炎...

【专利技术属性】
技术研发人员：董发明，李凯明，邱妍，杨国栋，邢艳丽，梁立钦，李凯强，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41