一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，由以下方法制备而成：从草炭土溶水搅拌稀释后制得的上清液获得初级菌种，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体逐级富集发酵培养，将发酵液进行浓缩，即得本发明专利技术的联合微生物固氮制剂。本发明专利技术的固氮菌剂首次从草炭土中获得氢氧化细菌，并通过与固氮菌以及真菌进行联合培养，获得具有植物促长功能的复合菌种，可以作为高效有机液肥。本发明专利技术的固氮制剂原料来源广泛价格低廉，制作成本较低，同时制备该固氮菌剂的方法也较为简单，无需额外提供氢气支持氢氧化细菌的培养，适用于产业化。本发明专利技术首次利用高浓度工业有机废水作为微生物的培养基，实现了废物资源利用的高价值转化。

A combined microbial nitrogen fixation preparation based on hydrogen oxidizing bacteria and its preparation method

The invention provides a combined microbial nitrogen fixation preparation based on hydrogen oxidizing bacteria, which is prepared by the following methods: obtaining primary bacteria from the supernatant prepared by mixing and diluting the dissolved water of peat soil, separating the waste water rich in organic matters from solid to liquid, inoculating the primary bacteria to the separated liquid for progressive enrichment and fermentation, and concentrating the fermentation liquid, namely, obtaining the combined micro of the invention Biological nitrogen fixation preparation. The nitrogen fixing bacterial agent of the invention obtains the hydrogen oxidizing bacteria from the peat soil for the first time, and through the joint cultivation with the nitrogen fixing bacteria and fungi, obtains the composite bacteria with the plant growth promoting function, which can be used as the high-efficiency organic liquid fertilizer. The nitrogen fixing preparation of the invention has a wide range of raw materials, low price and low production cost. At the same time, the preparation method of the nitrogen fixing preparation is relatively simple, and there is no need to provide additional hydrogen to support the cultivation of hydrogen oxidizing bacteria, which is suitable for industrialization. The invention uses high concentration industrial organic waste water as the culture medium of microorganism for the first time, realizing the high value transformation of waste resource utilization.

【技术实现步骤摘要】
一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法。
技术介绍
微生物固氮制剂在农林业领域具有重要且广泛的应用，能够促进植物生物固氮、改善土壤肥力、提高植物矿物元素的吸收利用，增强植物的抗病、抗旱能力、提高产量、改善品质等作用，在发展绿色农业、生态农业方面具有不可替代的作用。根系促长微生物(PGPR)是多种微生物的联合促长机制发挥作用而促进植物生长，也是农业微生物领域研究的重点。微生物制剂研究及应用较多集中在根瘤菌、固氮菌、解磷、钾等领域。氢氧化细菌(Hydrogen-oxidizingbacteria)，又称氢氧混合气细菌(Knallgasbacteria)，是一些呈革兰氏阴性的好氧或者兼性的化能无机营养菌(lithoautrophs)。细胞膜上有泛醌、维生素K2及细胞色素等呼吸链组分。它们能用氢气和氧气分子做为电子供体和受体，快速固定CO2，通过1,5-二磷酸核酮糖(RuBP-ribulosebiphosphate)或者逆三羧酸循环(reversetricarboxiliccycle)进行细胞合成。更重要的是：它们还能够通过氧化糖、有机酸和氨基酸等有机物来获取能量，因此属于兼性化能的营养模式，在异养模式中，CO2被固定在某种有机酸上，以有机化能方式进行反应。它们能够生存在氧气浓度波动较大的低氧缺氧区，这使得它们能与厌氧产氢细菌共生。多数氢氧化细菌中有两种与氢的氧化有关的酶，一种是位于壁膜间隙或结合在细胞质膜上的不需要NAD+的颗粒状氧化酶它能够催化以下反应：H2→2H++2e-该酶在氧化氢并通过电子传递系统传递电子的过程中，可以驱动质子的跨膜运输，形成跨质子梯度，为ATP的合成提供动力；另一种是可溶性氢化酶，它能催化氢的氧化，而使NAD+还原的反应。所生产的NADH主要用于CO2的还原。根据吉布斯自由能的理论公式计算，这个过程会产生大量的能量和生成ATP，所以能够自发进行以下反应：(1)H2(g)+1/2O2(g)→H2O(L)△GO＝-237.1kJ/mole(2)ADP+Pi→ATP△GO＝+30.5kJ/mole(3)H2(g)+1/2O2(g)+7(ATP+Pi)→H2O+7ATP△GO＝-23.6kJ/mole氢氧化细菌还能生成微生物单细胞蛋白(Singlecellprotein-SCP)、供发酵工业用的生物质，它们在新陈代谢机理上超高的灵活性和多功能性——不仅能在异养和自养模式间轻松切换(自养是指细菌以CO2为碳源营养物质，异养是指以有机化合物为碳源营养物质)，也可以实现两种状态同步反应。也就是说在异养模式下反应产生的CO2继续以自养模式进一步反应。并且可以间歇或者连续进行。它依靠NAD+的溶解性氢化酶还原吡啶核苷酸用于生物合成，而颗粒氢化酶则引导电子从氢直接到电子传递链以产生质子动力势。其自养模式新陈代谢的机理为：21.36H2+6.21O2+4.09CO2+0.76NH3→C4.09H7.13O1.89N0.75+18.70H2O其异养模式新陈代谢的机理为：nH2+nO2+有机酸/nCO2+nNH3→C4.09H7.13O1.89N0.75+nH2O上述反应机理表明：氢氧化细菌具备优异的合成氨基酸/蛋白质功能。该反应模式是基于氢氧化细菌在单菌种好氧/自养条件下进行，而氢氧化细菌具备好氧/厌氧、自养/异养自由切换的功能优势，但好氧/异养模式需跟其他细菌联合作用才会有高效率的合成反应。目前国内外的学术研究仅做到好氧/自养模式合成氨基酸/多肽/蛋白质的阶段，且仅仅是实验室成果阶段，还未实现工程验证，仅处于展望阶段。而好氧/异养模式还未见与其他细菌联合培养的报导。难点在于实验条件下的联合菌种的选择、组合机理、培养条件和方法等，学术界尚未有成功的、可靠的研究结果。但自然界中却大量存在氢氧化细菌与其他菌种的共生现象，因此，联合培养的研究方向是可行的。生物固氮是指一些特殊的原核生物能够将分子态氮还原为氨，然后再由氨转化为各种细胞物质，微生物将氮还原为氨的过程称为生物固氮。总反应式为(图3)：N2+8H++8e-+nATP→2NH3+H2+nADP+nPi根据生物固氮反应式，固氮菌每固定一个N2，至少释放一个H2，不同的固氮菌释放的H/N比例不同。研究表明：如果固氮菌释放的H2不被其他微生物吸收，则大量聚集的H2会导致植物根圈范围O2、CO2失衡，会抑制固氮菌及其他菌种的呼吸和代谢循环，降低了固氮效果。而氢氧化细菌刚好具备吸收H2并合成氨基酸/蛋白质的功能，可以实现固氮菌的呼吸和代谢平衡。具有生物固氮作用的微生物近50个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌。根据固氮微生物与高等植物以及与其他生物的关系，可分为3大类：自主固氮系、共生固氮系和联合固氮系。好氧自生固氮以固氮菌属(Azotobacter)较为重要，固氮能力较强。共生固氮菌中较为常见的是根瘤菌(Rhizobium)，它与其所共生的豆科植物有严格的种属特异性。此外，弗兰克氏菌(Frankia)能与非豆科植物共生固氮。联合固氮中比较研究普遍的有固氮螺菌属(Azospirillum)、假单孢菌属(Pseudomouas)等。固氮菌种单独培养方法比较成熟且应用较广，但与其他菌种联合培养的并应用的不多。根据前述分析，氢氧化细菌组合固氮菌进行联合培养的研究方向是可行的。微生物自身的繁殖除了需要N源，还需要C源，植物生长除了光合作用吸收空气中的CO2以外，也需要从根系中吸收C源。因此研究氢氧化细菌联合固氮菌的同时，还要考虑C源的问题。真菌是不含叶绿体、化能有机营养的真核微生物，在自然界的C元素循环和N元素循环中起主要作用，典型的异养型生物，它们参与有机含碳化合物的分解、转化并生成CO2，可为植物生物固氮提供无机碳源和有机碳源。其中子囊菌门和担子菌门的一些菌属可以把富含有机物的物质转化成各种酶及有机酸，也可以广泛应用于工业发酵领域；另外，子囊菌门和担子菌门的一些菌属可产生有隔膜的菌丝体、且菌丝体可融合形成网络型菌丝联合体，再结合其他细菌与植物根系形成共生体(VA菌根)，是PGPR的重要组成部分。根据前述氢氧化细菌的生理及功能特性，氢氧化细菌在微生物固氮、植物促长等领域具有重要、广泛的应用价值，但成熟、高效、低成本、易于产业化的培养方法目前还是研究难点。常见的培养方法如果采用无机自养模式富集培养法，需要人工供应CO2、H2；如采用异养模式限定培养基方法，培养出的菌种丰度比不高，不利于产业化应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂及其制备方法，该方法适用于产业化。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：第一方面本专利技术提供了一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，由以下方法制备而成：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，由以下方法制备而成：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体逐级富集发酵培养，将获得的第五级发酵液进行浓缩，即得基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，由以下方法制备而成：由氢氧化细菌、固氮菌以及真菌联合培养获得初级菌种后，将富含有机物的废水进行固液分离，将初级菌种接种至分离的液体逐级富集发酵培养，将获得的第五级发酵液进行浓缩，即得基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂。


2.如权利要求1所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述富含有机物的废水为工业有机废水、禽畜废水、生活污水或汽车涂装水性涂料废水。


3.如权利要求2所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述富含有机物的废水为汽车涂装水性涂料废水。


4.如权利要求1所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述联合微生物固氮制剂包含以下菌种：氢氧化细菌、固氮菌、子囊菌门真菌和担子菌门真菌；其中所述复合菌种的总菌含量＞3×108个/ml；氢氧化细菌在所述复合菌种中的总丰度比为55-70％，菌含量＞1.1×108个/ml。


5.如权利要求4所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述氢氧化细菌为氢噬胞菌HydrogenophagalaconesensisHWB-10T和假单胞菌PseudomonaswadenswilerensisCCOS864T；所述固氮菌为固氮螺菌AzospirillumrugosumIMMIBAFH-6T和蓝藻固氮菌ElsteracyanobacteriorumTH019T；所述子囊菌门真菌为VaricosporellopsisaquatilisJW75003或/和AtractiumcrassumCBS180.31T或/和Paracremoniumsp.CBS143277中的一种或几种；所述担子菌门真菌为Unculturedfungusclone(KU534750)或/和UnculturedBasidiomycotaclone(KU000527)。


6.如权利要求5所述的基于氢氧化细菌的联合微生物固氮制剂，其特征在于，所述氢噬胞菌HydrogenophagalaconesensisHWB-10T的丰度比为45-55％，菌含量＞9×107个/ml；所述假单胞菌PseudomonaswadenswilerensisCCOS864T的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述固氮螺菌的丰度比为10-15％，菌含量＞2×107个/ml；所述蓝藻固氮菌的丰度比为3-5％，菌含...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁文豪，韩允奉，
申请(专利权)人：广东丽豪生物农业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44