寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物制造技术

本发明专利技术属于蛋白质缀合物领域。更具体地，本发明专利技术涉及用于治疗代谢障碍或病况的共价连接有Fc单体多肽的寡聚体延伸的胰岛素，并且涉及产生这类寡聚体延伸的胰岛素‑Fc缀合物的方法。本发明专利技术还涉及新型Fc片段、中间产物，并且涉及这类中间产物在合成本发明专利技术的寡聚体延伸的胰岛素‑Fc缀合物的方法中的用途。最后，本发明专利技术提供了包含本发明专利技术的寡聚体延伸的胰岛素‑Fc缀合物的药物组合物，并且涉及这类组合物在治疗或预防与代谢障碍或病况相关的医学状况中的用途。

Insulin FC conjugates with oligomer extension

The invention belongs to the field of protein conjugates. More specifically, the present invention relates to insulin covalently linked with oligomer extensions of FC monomeric polypeptides for the treatment of metabolic disorders or conditions, and to a method of producing insulin \u2011 FC conjugates of such oligomer extensions. The invention also relates to novel Fc fragments, intermediates, and the use of such intermediates in the process of synthesizing the insulin \u2011 FC conjugate of the oligomer extension of the invention. Finally, the invention provides pharmaceutical compositions comprising insulin \u2011 FC conjugates of the oligomer extension of the invention, and relates to the use of such compositions in the treatment or prevention of medical conditions related to metabolic disorders or conditions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物
本专利技术属于蛋白质缀合物领域。更具体地，本专利技术涉及用于治疗代谢障碍或病况的共价连接有Fc单体多肽的寡聚体延伸的胰岛素，并且涉及产生这类寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物的方法。本专利技术还涉及新型Fc片段、中间产物，并且涉及这类中间产物在合成本专利技术的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物的方法中的用途。最后，本专利技术提供了包含本专利技术的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物的药物组合物，并且涉及这类组合物在治疗或预防与代谢障碍或病况相关的医学状况中的用途。
技术介绍
寡聚体延伸的胰岛素是通过用寡聚体(由氨基酸残基组成)延伸胰岛素的A链和/或B链而产生的胰岛素。Fc融合蛋白(有时被称为肽体)是通常通过融合(即，连接原本编码单独蛋白质的两个或更多个基因)生物活性多肽与免疫球蛋白G的片段可结晶区(Fc结构域)而生成的嵌合蛋白，并且融合蛋白通常组合其组成部分的性质，例如，凭借与新生Fc受体FcRn结合而具有长血清半衰期的IgG样性质。另一方面，蛋白质缀合物是具有“大的”、通常为重组的效应分子(例如IgG-Fc或白蛋白)的化合物，该效应分子经由合成连接体(例如PEG连接体)与治疗性多肽共价结合。蛋白质缀合物可用于多种情况，并且复杂性增加的生物治疗性化合物的鉴定和开发已提高了对用于制备这类化合物的有吸引力的方法的关注。由于蛋白质不像传统化学部分那样稳定，因此连接两个或更多个蛋白质出现了困难，并且传统反应化学可能无法在不损害蛋白质的情况下应用。此外，选择性问题使连接两个或更多个蛋白质变得复杂。蛋白质和肽的半衰期可以通过与Fc融合而延长。然而，由于胰岛素是双链多肽，其被表达为单链类似物，随后通过酶处理而获得双链多肽，这对于蛋白质融合而言并非理想的。此外，融合仅限于N-端和/或C-端。因此，例如为了通过Fc的作用而延长胰岛素的半衰期，就需要化学缀合。当缀合两个蛋白质时，连接体的性质至关重要。短连接体可能会影响各自蛋白质的活性。使两个蛋白质过于接近可能会影响分子的生物物理稳定性。可以影响这一点的连接体性质可以是，例如，第二分子上的缀合位置、连接体的长度、连接体的柔性、连接体的极性。在一些情况下，优选柔性连接体，而在其它情况下，需要刚性的连接体。将分子/蛋白质与第二分子缀合可能对缀合物的生物物理性质具有负面影响，这可以通过连接体性质来解决。WO2011/122921描述了具有改善的体内持续时间的胰岛素缀合物，该缀合物通过经由亲水性非肽基(例如PEG)连接体共价连接胰岛素与免疫球蛋白Fc区来制备，该连接体在两端具有反应性基团(例如，作为丙醛的醛官能团)，即所谓的同双官能连接体。所用的PEG连接体是多分散性的，其大小为3.4KDa至10KDa，并且多分散性连接体的使用对最终产物的合成和分析造成挑战。WO2016/178905描述了融合蛋白，其包含通过使用肽连接体与人IgGFc区融合的胰岛素受体激动剂。WO2016/193380描述了新型胰岛素或胰岛素类似物，其延伸出主要为极性的氨基酸残基的序列，以便改善药物物质的半衰期和稳定性。获得蛋白质与肽、小分子或延长体(protractor)聚合物之间的位点特异性缀合物的最常见方式为利用Cys的巯基和N-端氨基酸的伯氨基的独特亲核性质，以及Lys侧链的ε-NH2作为反应性处理点。赖氨酸通常富含于蛋白质中(Fc含有超过30个赖氨酸残基)，这限制了赖氨酸作为化学处理点的应用。但是，在胰岛素的情况下，仅存在一个赖氨酸(即在位置B29处)。另一方面，半胱氨酸在蛋白质中不常见，并且通常参与形成二硫键。半胱氨酸可以通过遗传工程而引入。然而，就胰岛素而言，这种修饰已被证明是困难的，特别是由于低表达产率和各种折叠问题。将两个蛋白质通过它们各自的Cys、N-端氨基或Lys残基而位点特异性地缀合在一起同样具有挑战性。异双官能连接体的使用可以用于该目的。另外，更具挑战性的是缀合如下两个蛋白质的任务，其中一个蛋白质通过源自还原的二硫键的两个硫原子而被连接。
技术实现思路
我们已经开发并在此提供三触角连接体，其中至多两个末端是相同的，并且能够与蛋白质的还原的巯基部分形成稳定的共价键，而其余的末端不受该蛋白质内的巯基或其它任何残基的影响。这种方法特别适用于通过桥接两个感兴趣的蛋白质的天然二硫键(当它们还原为游离巯基时)来缀合它们。与相似的非缀合的和非延伸的类似物相比，本专利技术的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物显示出胰岛素受体亲和力降低。胰岛素受体亲和力的这种降低有助于胰岛素-Fc缀合物在循环中的作用延长，因为胰岛素在受体活化后内化并降解。因此，本专利技术的胰岛素-Fc缀合物的清除率降低。胰岛素受体亲和力的这种降低可能不会导致效力的丧失，例如，如在标准高胰岛素血症血糖钳夹试验中所测量的，并且高FcRn结合和低胰岛素受体亲和力的组合被认为对于获得本专利技术胰岛素-Fc缀合物的长时间持续作用是有益的。因此，在其第一方面，本专利技术提供了由式I表示的新型寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物：其中，OEF、Ins、X、Y和Fc'如下文所定义。在另一方面，本专利技术提供了由式I’表示的新型寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物：其中，OEF、Ins、X、U、Z和S-Fc'如下文所定义。本专利技术的胰岛素-Fc缀合物显示出改善的药代动力学和/或药效学谱。在本专利技术的一方面，本专利技术的化合物显示出增加的药效学效力。在本专利技术的另一方面，与目前销售的长效胰岛素相比，本专利技术的化合物显示出至少两倍增加的药效学效力。在本专利技术的又一方面，本专利技术的化合物在生理pH下具有增加的溶解度。在本专利技术的另一方面，本专利技术的化合物具有延长的体内半衰期。在进一步的方面，本专利技术提供了新型中间体化合物，并且涉及这类产物在制备本专利技术胰岛素-Fc缀合物的方法中的用途。一方面，本专利技术提供了用作中间体的新型[OEF-胰岛素]构建体，即式II的中间体化合物：[OEF-Ins]其中，OEF代表与胰岛素A链C-端融合的或与胰岛素B链N-端融合的极性重组延伸体，该延伸体包括一个或多个以下氨基酸残基：Ala(A)、Asp(D)、Glu(E)、Gly(G)、Pro(P)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)，与赖氨酸(K)残基组合；并且Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子。另一方面，本专利技术提供了用于制备本专利技术胰岛素-Fc缀合物的新型Fc片段。在第三方面，本专利技术提供了用于制备本专利技术的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物的新型中间体。该中间体化合物可以用通式V来表征：M-X-Y(-LG)2其中，M代表对伯氨基具有反应性的离去基团；X如以下针对式I所定义，并且代表二价连接基团；并且Y如以下针对式I所定义，并且代表中央三价连接单元，其将两个离去基团(LG)2连接至X；或者X代表共价键，并且Y代表将两个离去基团(LG)2连接至离去基团本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.由式I’表示的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物：/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170405 EP 17164950.2;20171220 EP 17208780.1;20181.由式I’表示的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物：



其中
Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子；
OEF表示与胰岛素A链C-端融合的或与胰岛素B链N-端融合的极性重组延伸体，该延伸体包括一个或多个以下氨基酸残基：Ala(A)、Asp(D)、Glu(E)、Gly(G)、Pro(P)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)，其与赖氨酸(K)残基组合，以得到[OEF-Ins]构建体；
所述[OEF-Ins]构建体经由赖氨酸(K)残基的ε氨基连接至三价连接基团X-U(-Z)2；
X代表连接[OEF-Ins]与U的共价键或二价连接基团；
U代表将两个Z-[S-Fc’]基团连接至X的中央三价连接单元；或者，在X代表共价键的情况下，U将两个Z-[S-Fc’]基团连接至所述[OEF-Ins]构建体中的赖氨酸残基的ε氨基；
Z不存在或代表将中央连接单元(U)连接至单体Fc多肽(Fc’)或其片段的巯基部分(S)的二价连接基团；或者，在Z不存在的情况下，U直接连接至[S-Fc’]；并且
[S-Fc’]代表Fc’组分(即单体Fc多肽或其片段)，其中S代表源自包含于该Fc’组分内的半胱氨酸(C)残基的硫原子。


2.根据权利要求1所述的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物，其中X代表
共价键；
结构-C(O)-(CH2)l-C(O)-的二价连接体，其中l代表1至20范围内的整数；或
结构-C(O)-(CH2)o-NH-C(O)-的二价连接体；其中o代表1至20范围内的整数。


3.根据权利要求1-2中任一项所述的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物，其中所述中央三价连接单元(U)和二价连接基团(Z)由式IV’表示



其中，
N是氮原子并且代表根据式I’的中央连接单元(U)；
L1-NH(CO)-L3和L2-NH(CO)-L4分别代表根据式I’的二价连接基团(Z)；
*表示与源自Fc的二硫键(即根据式I’的[S-Fc’]部分)的硫原子的连接点；
#表示与X的连接点；并且
L1和L2彼此独立地代表-(CH2)m1-；其中
m1代表1至6范围内的整数；并且
L3和L4彼此独立地代表-(CH2)n1-；
其中n1代表1至6范围内的整数。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物，其中X代表共价键并且其中U-(-Z)2代表如式VII所示的3,5-二取代的苯甲酰基部分：



其中
*表示与源自Fc的二硫键(即根据式I’的[S-Fc’]部分)的硫原子的连接点；
#表示与所述[OEF-Ins]构建体中的赖氨酸残基的ε氨基的连接点；并且
L9和L10彼此独立地代表-(CH2)n3-；其中
n3代表1至6范围内的整数。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物，其中
Ins代表含有一个或多个以下置换的人胰岛素类似物：A14A或A14E、A21G或A21Q、B3Q、B16E或B16H、B25H、B29R和desB30。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物，其中
OEF代表与胰岛素A链C-端融合的或与胰岛素B链N-端融合的极性重组OEF延伸体，该延伸体包括一个或多个以下氨基酸残基：Ala(A)、Glu(E)、Gly(G)、Pro(P)和Gln(Q)，其与赖氨酸(K)残基组合，以得到[OEF-Ins]构建体，该OEF的氨基酸残基总数在15至110的范围内。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物，其中Fc’代表IgG1Fc多肽、IgG2Fc多肽、IgG4Fc多肽的单体或其片段。


8.根据权利要求1所述的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物，其为
(A14E,A21G,A22(GQEP)19,A98K^,A99P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQEP)19,A98K^,A99P,B3Q,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,B(-78K^),B(-77P),B(-1)(GQAPGQAPGQEP)6-GQAP,B3Q,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,B(-78K^),B(-77P),B(-1)(GQEP)19,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQAPGQAPGQEP)6-GQAP,A98K^,A99P,B3Q,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQEP)19,A98K^,A99P,B3Q,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQEP)6,A46K^,A47P,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQAPGQEP)6,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQEP)3,A34G,A35Q,A36E,A37K^,A38P,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235KhIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,B(-78K^),B(-77P),B(-1)(GQEP)19,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
(A14E,A21G,A22(GQEP)19,A98K^,A99P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(227A,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQAPGQAPGQEP)6-GQAP,A98K^,A99P,B3Q,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
A14E,A21G,A22(GQAPGQEP)6,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素/(227A,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
(A14E,A21G,A22(GQAP)19,A98K^,A99P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(227A,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(228-447))4-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-4-氧代-丁酰基缀合物；
(A14E,A21G,A22(GQAP)19,A98K^,A99P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(227A,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(228-447))6-[双[2-[(2-乙酰基)氨基]乙基]氨基]-6-...

【专利技术属性】
技术研发人员：TM塔格莫斯，P玛德森，TB克尔森，L普利达尔，L德玛利亚，林兆生，万哲，张媛媛，L利克，MWB蒙泽尔，JT柯德拉，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK