千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体涉及千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明专利技术发现盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药在体内外都具有良好的抑癌效果，提供了更多的治疗实体瘤方案，且两种联用药物来源广，经济有效。本发明专利技术首次发现了通过使用自噬抑制剂来加强盐酸千金藤碱在体内外的抗癌作用，并在体内小鼠模型上验证，提供一种新型的治疗实体瘤有效，可行的方案。

Application of stephanine combined with autophagy inhibitor in the preparation of drugs for the treatment of liver cancer

The invention belongs to the technical field of medicine, in particular to the application of the combination of stephanine and autophagy inhibitor in the preparation of drugs for the treatment of liver cancer. The invention finds that the combination of stephanine hydrochloride and autophagy inhibitor has good anti-cancer effect in vivo and in vitro, provides more treatment schemes for solid tumors, and the two combined drugs have wide sources and are economical and effective. The invention is the first time to find a new effective and feasible scheme for solid tumor treatment by using autophagy inhibitor to enhance the anticancer effect of Sinomenine Hydrochloride in vitro and in vivo, and verified on the mouse model in vivo.

【技术实现步骤摘要】
千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用
本专利技术属于医药
，具体涉及千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。
技术介绍
千金藤碱(cepharanthine,CEP)是从防己科植物头花千金藤中提取出来的单体化合物，属于生物碱一类，其被日本卫生部批准用于临床上治疗放疗导致的白细胞减少症，斑秃等。已有研究表明千金藤碱具有抗病毒，抗炎，抗肿瘤等多种活性，且尚未发现其存在安全问题，副作用报道甚少。在合理的用药下千金藤碱还具有调节免疫，维持细胞膜稳定性，促进血管循环等作用。一般地，千金藤碱会被制备成粉末，片剂，针剂的形式用于治疗。并且越来越多的研究表明千金藤碱能够逆转肿瘤的耐药性以及作为辅助药物治疗肿瘤，但因自噬会促使肿瘤存活而降低抗肿瘤药物的效果，千金藤碱单用抑制肿瘤过程中细胞自噬发挥何种作用，目前没有过多的报道，关于千金藤碱与细胞自噬的报道到目前为止也仅有几篇，结论却不尽相同。我们发现自噬对肿瘤细胞的保护机制，进而用千金藤碱与自噬抑制剂联用来达到抗肿瘤效果，而千金藤碱与自噬抑制剂联用尚未见有报道，他们联用的剂量就更没有相关报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术提供了千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。进一步地，所述千金藤碱的剂量为1-1000mg/kg。进一步地，所述千金藤碱的剂量为20mg/kg。进一步地，所述自噬抑制剂的剂量为1-1000mg/kg。进一步地，所述自噬抑制剂的剂量为50mg/kg。进一步地，所述千金藤碱与自噬抑制剂的质量比为1:1-10。进一步地，所述千金藤碱与自噬抑制剂的质量比为1:2.5。进一步地，所述自噬抑制剂为自噬溶酶体抑制剂氯喹。进一步地，所述千金藤碱为盐酸千金藤碱。本专利技术首先检测了盐酸千金藤碱单用对于不同肝癌细胞生长的影响。本专利技术选用1-100uM的盐酸千金藤碱，测定该范围内盐酸千金藤碱对正常肝癌细胞HL-7702细胞株和肝癌细胞：SMCC-7721、Huh7、HepG2细胞株的药物毒性；优选5uM盐酸千金藤碱验证其在体外对癌细胞的增殖，迁移，侵袭以及促凋亡作用。本专利技术通过实验验证了千金藤碱单用对肝癌细胞生长的影响后，进一步用自噬抑制剂与盐酸千金藤碱联合用药在体外抑制癌细胞生长。优选氯喹作为自噬抑制剂与盐酸千金藤碱联合用药在体外抑制癌细胞生长。优选盐酸千金藤碱与氯喹1:7.5的比例在体外抑制癌细胞，用CompuSyn软件分析两者的联用治疗癌症联合指数。本专利技术在体外验证得到了盐酸千金藤碱与自噬抑制剂氯喹联用后具有抑癌作用后，进一步在裸鼠体内进行进一步的体内实验验证。异体移植方式在裸鼠体内构建实体瘤模型，随机分组后；根据体外实验的联合指数计算出加药量，每天给小鼠联合用药，根据测量小鼠肿瘤大小，体重，各项脏器的异常情况来表征发现，盐酸千金藤碱与氯喹联合用药的确有较好的治疗效果，并对其他组织无副作用。本专利技术证实了盐酸千金藤碱在体内体外都具有抑制肿瘤的作用，并且与自噬抑制剂氯喹使用时，在体内外抑制肿瘤效果更好。与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：(1)本专利技术所选抗癌药物盐酸千金藤碱为临床上已批准使用的天然产物，副作用小甚至无，获取方式简单且经济；(2)本专利技术发现盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药在体内外都具有良好的抑癌效果，提供了更多的治疗实体瘤方案，且两种联用药物来源广，经济有效；(3)自噬保护机制对肿瘤的存活及增殖有重要的作用，本专利技术首次发现了通过使用自噬抑制剂来加强盐酸千金藤碱在体内外的抗癌作用，并在体内小鼠模型上验证，提供一种新型的治疗实体瘤有效，可行的方案。附图说明图1是实施例1盐酸千金藤碱抑制各株肝癌细胞存活的拟合曲线图；图2是实施例2中划痕实验结果图；图3是实施例2中克隆形成实验结果图；图4是实施例2中transwell小室检测细胞侵袭的结果图；图5是实施例2中凋亡实验结果图；图6是盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药的联合指数分析图；图7是盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤的重量的影响；图8是盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤生长率的影响；图9是随着时间变化盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤生长率的影响。具体实施方式下面结合实施案例对本专利技术进行详细的说明。以下实施案例有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提在，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1用电子天平称取盐酸千金藤碱粉末，加入到DMSO中溶解，配成浓度为100mM的母液，后用DMSO稀释成不同的浓度。用MTT的方法检测盐酸千金藤碱对正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞SMCC-7721，Huh7，HepG2细胞24h和48h的毒性，并且计算得到盐酸千金藤碱对不同肝癌细胞的IC50值。具体方法：将正常肝细胞HL-7702用胰酶消化后接种到96孔板中，每孔接种细胞0.4×104，过夜培养待贴壁后，将0-100uM的盐酸千金藤碱加到培养皿中，分别在培养24h和48h时加入10uLMTT(5mg/mL)，37℃孵育4h后吸去培养液和MTT，加入DMSO，在摇床上室温反应30min在570nm处测定吸光值，后用GraphPadPrism8绘制药物浓度对应细胞存活率的拟合曲线，其他细胞的操作同HL-7702。盐酸千金藤碱抑制各株肝癌细胞存活的拟合曲线图如图1所示。图1的结果显示，盐酸千金藤碱对肝癌细胞的毒性具有浓度依赖性，随着时间延长，毒性作用无明显差异，但对正常肝细胞具有时间依赖性，并且与正常肝细胞相比，盐酸千金藤碱对肝癌细胞的毒性更大。实施例2在实施例1的前提下，本专利技术进一步验证了盐酸千金藤碱对肝癌细胞的生长的确有影响就进一步进行了划痕，克隆形成，TransWell，以及流式分选仪检测凋亡细胞实验。划痕实验具体方法：先在12孔板外表面底部画黑色横线，然后用胰酶消化Huh7细胞后将20×104个细胞接种到12孔板中，培养过夜。待细胞贴壁后，用PBS洗一遍后用200uL枪头在12孔板内表面底部划横线，与外表面的横线相互垂直，造成细胞划痕，完成过程后，用PBS清洗，分为3组(对照组(以control表示)，顺铂组(以CDDP表示)，盐酸千金藤碱组(以CH表示))，顺铂组和盐酸千金藤组分别用含顺铂、盐酸千金藤碱的培养基培养后，分别在0h，24h以及48h拍照记录。划痕实验结果图如图2所示，与抗癌阳性药物CDDP类似，CH抑制肝癌细胞的迁移。克隆形成实验具体方法：将用胰酶消化下来的Huh7细胞接本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。


2.如权利要求1所述的千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述千金藤碱的剂量为1-1000mg/kg。


3.如权利要求2所述的千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述千金藤碱的剂量为20mg/kg。


4.如权利要求1所述的千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述自噬抑制剂的剂量为1-1000mg/kg。


5.如权利要求4所述的千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述自噬抑制剂的剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，王瑶，苏桂锋，黄泽秀，
申请(专利权)人：广州暨南生物医药研究开发基地有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44