一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法。该方法利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力4个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌保鲜菌株的快速筛选方程：Y=0.151A+0.285B+0.029C+0.207D+0.184E+0.178F。其中，Y为综合得分，A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成率，E为发酵上清液抑菌率，F为点种抑菌率。当0≤Y20%为低保鲜活性枯草芽孢杆菌，20%＜Y＜40%为中保鲜活性枯草芽孢杆菌，40%≤Y≤100%为高保鲜活性枯草芽孢杆菌。通过方程能够快速筛选得到具有高保鲜活性的枯草芽孢杆菌菌株。

A rapid screening method for Bacillus subtilis

The invention discloses a fast screening method for a Bacillus subtilis fresh keeping strain. The rapid screening equation of Bacillus subtilis fresh-keeping strains was established by using four indexes of cell adhesion, including hydrophobicity, self cohesion, coacervation and biofilm forming ability, and two indexes of bacteriostasis of fermentation supernatant and inoculation: y = 0.151a + 0.285b + 0.029c + 0.207d + 0.184e + 0.178f. Among them, y is the comprehensive score, a is the self coacervation rate, B is the hydrophobic rate, C is the coacervation rate, D is the biofilm formation rate, e is the bacteriostatic rate of the fermentation supernatant, f is the bacteriostatic rate of the spot seed. When 0 \u2264 Y20% is Bacillus subtilis with low fresh-keeping activity, 20% is Bacillus subtilis with medium fresh-keeping activity, 40% is Bacillus subtilis with high fresh-keeping activity. Through the equation, the Bacillus subtilis strains with high fresh-keeping activity can be quickly screened.

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法
本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法。
技术介绍
我国是世界上水产品产量最大的国家，鱼类养殖是我国主要的水产经济，如何有效保持水产鱼的鲜度和延长货架期是制约我国水产养殖业发展的重要问题。水产品含有丰富的蛋白质等营养物质，容易引起鱼体的腐败，导致水产品的变质，甚至影响水质和人体健康安全。因此，对水产保鲜技术的研究是当前的研究热点。当前对水产品的保鲜主要是通过低温保藏和化学保鲜两种方式，过低的温度会影响水产品原有的风味，化学防腐保鲜技术的应用虽然有效延长了水产品的保质期，但是部分化学物质会与鱼肉发生反应从而影响其风味，同时存在对人体的健康安全隐患。枯草芽孢杆菌是一种重要的微生态制剂，是被广泛应用于水产中的优质益生菌，且也被中国、美国FDA等列为安全的微生物菌株。它具有拮抗其他菌株黏附宿主、通过群体感应机制拮抗其他细菌成膜并生产抑菌活性物质抑制微生物生长等多种抑菌功能。因此，基于枯草芽孢杆菌的抑菌原理，利用黏附和抑菌指标可以筛选得到高效的微生态保鲜菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法。该方法利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率，枯草芽孢杆菌2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌菌株的快速筛选方程。该方程为得到高黏附性具有保鲜效果的枯草芽孢杆菌提供快速筛选方法。快速筛选所得高黏附效果的枯草芽孢杆菌用于鱼片保鲜，保鲜活性高，保鲜期长。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法：利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力4个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌菌株的快速筛选方程，通过方程快速筛选具有高保鲜活性的枯草芽孢杆菌菌株。上述方法中，建立的枯草芽孢杆菌保鲜菌株的快速筛选方程为：Y=0.151A+0.285B+0.029C+0.207D+0.184E+0.178F其中：Y为综合得分，A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成能力，E为上清液抑菌率，F为点种抑菌率。上述快速筛选方程中，当0≤Y20%为低保鲜活性枯草芽孢杆菌，20%＜Y＜40%为中保鲜活性枯草芽孢杆菌，40%≤Y≤100%为高保鲜活性枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌的疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力、抑菌活性及其上清液抑菌活性等测定方法如下：（1）疏水性：参考微生物黏着碳氢化合物法测定枯草芽孢杆菌的表面疏水性，取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0±0.05。吸取2mL各菌悬液和2mL二甲苯进行混合，涡旋混合120s，于室温静置30min分层。取1mL水相，测定其OD600nm，每组平行3管，以生理盐水为空白对照组。细菌表面疏水率=（1-OD/OD0）×100%，其中OD0和OD分别是与二甲苯混匀前后水相所得OD600。（2）自凝聚率：取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0±0.05。吸取4mL菌悬液置于10mL螺口试管中，室温静置5h后吸取1mL上层溶液测定OD600，每组每个时间点平行3管。细菌自凝聚率=（1-ODt/OD0）×100%，其中OD0和ODt分别是自凝聚前后上层溶液在600nm时测量所得吸光度值。（3）生物膜形成能力：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，弃上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0±0.05，与新鲜TSB按1:10稀释混匀，取200uL加至96孔酶标仪中，37℃静置培养24h后弃取培养液，用200ul无菌PBS轻柔清洗2次，除去游离菌，室温下干燥。每孔加入200uL0.1%结晶紫溶液，室温染色15min，弃去染液，去离子水清洗5次。完全干燥后，加入200uL95%乙醇溶液，待结晶紫充分溶解后，吸取100uL放于全新96孔板中，以结晶紫染色液为对照（一般为OD590nm=4），用多功能酶标仪检测OD590nm。生物膜形成率=ODt/4。（4）共凝聚率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，去上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，将菌液OD600值调整到0.5±0.02。腐败菌和益生菌各取1.5mL在一个试管中用旋涡振荡器充分混匀，30℃孵育4h后测定混合菌液的OD600nm值。每组做三个平行，以3ml单种菌液为对照。用Handley等的公式计算共凝聚率=[(SC+LC)/2-(S+L)/(SC+LC)/2]×100，SC、LC表示腐败菌或益生菌单独孵育4h的OD值，S+L表示混合菌孵育4h后的OD值。（5）点种抑菌率：枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂平板上，再用无菌牙签在新的牛肉膏蛋白胨培养皿中央点种接种益生菌并在30℃培养12h后，在益生菌画十字周边每隔1cm用无菌牙签点种腐败菌继续培养36h，记录最外层（A1）和最内层（A2）腐败菌的直径均值。计算公式：抑菌率（%）=（A1-A2）/A1×100%。（6）上清液抑菌率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min，取上清液过0.25um的滤膜制成无菌上清液。将OD600nm=0.7±0.02的腐败菌10ul分别加于1m牛肉膏蛋白胨液态培养基中，实验组加入80ul的益生菌无菌上清液，对照组不加入上清液，并在30℃下培养16h，酶标仪测定OD600.上述枯草芽孢杆菌发酵培养液通过以下步骤得到：（1）枯草芽孢杆菌发酵液的培养：分别从营养琼脂斜面培养基中挑取已活化的枯草芽孢杆菌，划线接种于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养12h，再将种子液以5%（v/v）接种量接种于新鲜的牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养24h得到发酵液。（2）枯草芽孢杆菌发酵液的制备：以新鲜牛肉膏蛋白胨液态培养基将（1）中所述发酵培养液菌浓度调至108CFU/mL。筛选方程的建立：随机选择分离自罗非鱼肠道和池塘的16株枯草芽孢杆菌（编号为BSS01-BSS16），对各自的4个细胞黏附指标和2个抑菌指标进行检测，通过以上指标进行SPSS主成分分析，得各指标在各因子得分系数矩阵（表1），三个主成分及其对应的归一化权重为0.4434、0.4092、0.1474，每个因子在每一主成分得分矩阵对应的系数乘以每一个指标的数据乘以各自所占权重，加总得到各指标的综合得分。设A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成率，E为上清液抑菌率，F为点种抑菌率，Y为综合得分，则加总得到各指标的综合得分，化简后的益生枯草芽孢杆菌得分公式如下，得分图见图1。Y=(A×0.467+B×0.467+C×-0.122+D×0.193+E×-0.056+F×-0.036)×44.34%+(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法，其特征在于：利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力4个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌保鲜菌株的快速筛选方程，通过方程快速筛选得到具有高保鲜活性的枯草芽孢杆菌菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法，其特征在于：利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力4个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌保鲜菌株的快速筛选方程，通过方程快速筛选得到具有高保鲜活性的枯草芽孢杆菌菌株。


2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法，其特征在于：所述快速筛选方程为：Y=0.151A+0.285...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雯，游佳鸿，倪莉，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35