用于Real-time PCR检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于Real‑time PCR检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法与应用。本发明专利技术提供的引物组序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，该引物组特异性强，灵敏度高，实用性强。采用Real‑time PCR进行检测，可以实现快速定性检测，假阳性率低，成本也低，适用现场快速检测。

Primer set, product, detection method and application for detection of Fusobacterium nucleatum by real time PCR

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a primer set, product, detection method and application for detecting Fusobacterium nucleatum by real time PCR. The primer group sequence provided by the invention is shown in SEQ ID No.1, SEQ ID No.2 and SEQ ID No.3. The primer group has strong specificity, high sensitivity and strong practicability. Using real \u2011 time \u2011 PCR for detection can realize rapid qualitative detection, with low false-positive rate and low cost, which is suitable for on-site rapid detection.

【技术实现步骤摘要】
用于Real—timePCR检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种用于Real-timePCR检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法与应用。
技术介绍
具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，F.nucleatum)是一种革兰氏阴性短杆菌，通常在口腔中普遍存在，与牙周炎的发病有关，并且与宫内感染、新生儿败血症、早产和阑尾炎等疾病相关。近年来越来越多的研究证实，具核梭杆菌在CRC病人的组织和粪便中富集并和CRC的发生、发展和预后有着密切的关系。结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是一种最常见的恶性肿瘤之一，在男性中排名第三，在女性中排名第二，近几十年来CRC的发生率呈不断上升的趋势。晚期CRC病人的5年生存率极低，早期CRC病人接受治疗后的5年生存率可达72％-100％，因此，对于CRC早期诊断至关重要。目前常用的CRC辅助诊断方法大体可分为可视化检查(结肠镜检查、CT肠造影检查、钡剂双对比造影检查、乙状结肠镜检查)和粪便检测(粪便免疫检测FIT、高灵敏度愈创木聚糖粪便潜血试验gFOBT、粪便免疫联合脱落物DNA检测)，但这些辅助诊断方法都存在有创或灵敏度低等问题。现常用的检测具核梭杆菌的方法有：细菌分离培养、血清学检测、免疫组织化学检测、宏基因组测序技术、聚合酶链式反应(PCR)等。但具核梭杆菌分离培养条件要求高、时间周期长且受组织和粪便中其他复杂因素影响大，临床分离鉴定不易执行。血清学检测和免疫组织化学检测灵敏度低，宏基因组测序对设备和技术要求高、成本高且耗时长，不适用于普通实验室和临床标本的检测，且这些方法都不能对具核梭杆菌进行定量检测。数字PCR检测需要特定的设备和条件，费用高昂，同样不适用于普通实验室和临床标本的检测。探针法实时定量荧光PCR技术需要合成荧光探针，成本较高。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)灵敏度较高，但容易受气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
针对现在临床标本中具核梭杆菌的分离培养较为困难且时间周期长，血清学检测和免疫组织化学检测灵敏度低，宏基因组测序和数字PCR检测对检测设备和技术要求高且成本高，LAMP检测假阳性率高，探针法实时定量荧光PCR成本较高，均不能较好的满足临床需求的现状，本专利技术提供了用于Real-timePCR(实时荧光定量PCR)检测具核梭杆菌的引物组、产品及检测方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：用于Real-timePCR检测具核梭杆菌的引物组，所述引物组包括：上游引物NusG-1F如SEQIDNO.1所示：5’-GCTTGAATTGGAAGCTAGAAGAGA-3’；第一下游引物NusG-1R如SEQIDNO.2所示：5’-GGGTCAGAACGAACTCCTACAA-3’；第二下游引物NusG-2R如SEQIDNO.3所示：5’-GGATCTGATCGAACTCCTACAA-3’。上述引物组在Real-timePCR检测具核梭杆菌或制备Real-timePCR检测具核梭杆菌的产品中应用。进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。一种试剂，包括上述引物组。一种试剂盒，包括上述引物组或试剂。进一步地，还包括2×TBGreenMix和无核酸酶水。一种具核酸杆菌的检测方法，以待检测样品基因组DNA为模板，上述引物组为引物进行Real-timePCR，若出现荧光信号则可判定待检测样品中存在具核梭杆菌。进一步地，利用检测出具核梭杆菌的待检测样品的Ct值与标准曲线进行对比计算，定量得到待检测样品中具核梭杆菌的数量；所述标准曲线为具核梭杆菌标准品数量与Ct值的关系曲线。进一步地，所述标准曲线的建立包括：等倍稀释已确定浓度的具核梭杆菌标准品，以稀释得到的各浓度的具核梭杆菌标准品为模板，以上述引物组为引物进行Real-timePCR，得到各浓度的具核梭杆菌标准品对应Ct值，得到标准曲线；优选地，所述具核梭杆菌标准品包括具核梭杆菌菌株或含有NusG基因的阳性质粒。进一步地，引物浓度为300nM-600nM；优选地，Real-timePCR的程序中退火温度为52-59℃。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)特异性强：本专利技术提供的引物组是根据具核梭杆菌基因组序列内的高度保守的NusG基因序列设计，得到的对具核梭杆菌具有特异扩增作用的Real-timePCR引物。研究证实，利用该引物组对具核梭杆菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、伤寒杆菌、变形链球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型溶血性链球菌、绿脓杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌进行检测，只在具核梭杆菌全基因组DNA中有扩增曲线，说明本专利技术所设计的引物组特异性强，用于检测具核梭杆菌准确可靠；(2)灵敏度高：本专利技术提供的引物组在进行Real-timePCR分析时，对具核梭杆菌的检测灵敏度可高达100CFU；(3)防止漏检：本专利技术提供的引物组包括3条引物，能有效的防止漏检；(4)实用性强：本专利技术的引物组，不仅能对纯培养的具核梭杆菌进行检测，也能对临床标本中的具核梭杆菌进行检测，与LAMP法相比，可实现临床标本中具核梭杆菌的准确快速检测，假阳性率低，在结直肠癌的筛查和临床辅助诊疗中有一定的应用价值；(5)检测成本低：本专利技术提供的引物组和具核梭杆菌的检测方法为染料法Real-timePCR，检测成本较现有宏基因组测序、数字PCR和探针法Real-timePCR低，更适用现场快速检测，为具核梭杆菌的非疾病诊断目的的鉴定检测提供简便方法，避免了分离培养鉴定的繁琐操作，缩短了鉴定时间，保证检测效果的同时降低了检测成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1中不同引物扩增曲线图；图2为实施例2中引物组对具核梭杆菌进行实时荧光定量PCR在不同退火温度下的扩增图；图3为实施例3中引物组的引物浓度为400nM的荧光定量PCR的扩增图；图4为实施例4中引物组特异性的检测结果图；图5为实施例5中标准品线性试验结果图；图6为实施例5中标准曲线图；图7为实施例6中ROC曲线。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。用于Real-timePCR检测具核梭杆菌的引物组，包括：上游引物NusG-1F如SEQIDNO.1所示：5’-GCTTGAATTGGAAGCTAGAAGAGA-3’；第一下游引物NusG-1R如SEQIDNO.2所示：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于Real‑time PCR检测具核梭杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括：上游引物NusG‑1F如SEQ ID NO.1所示：5’‑GCTTGAATTGGAAGCTAGAAGAGA‑3’；第一下游引物NusG‑1R如SEQ ID NO.2所示：5’‑GGGTCAGAACGAACTCCTACAA‑3’；第二下游引物NusG‑2R如SEQ ID NO.3所示：5’‑GGATCTGATCGAACTCCTACAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于Real-timePCR检测具核梭杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括：上游引物NusG-1F如SEQIDNO.1所示：5’-GCTTGAATTGGAAGCTAGAAGAGA-3’；第一下游引物NusG-1R如SEQIDNO.2所示：5’-GGGTCAGAACGAACTCCTACAA-3’；第二下游引物NusG-2R如SEQIDNO.3所示：5’-GGATCTGATCGAACTCCTACAA-3’。2.权利要求1所述的引物组在Real-timePCR检测具核梭杆菌或制备Real-timePCR检测具核梭杆菌的产品中应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。4.一种试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组或权利要求4所述的试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×TBGreenMix和无核酸酶水。7.一种具核酸杆菌的检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛倚澜，顿国栋，何晓弈，刘文正，邓铃，
申请(专利权)人：重庆博利达医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50