The invention discloses a rapid detection method for Staphylococcus aureus in offshore waters, the main steps of which are: 1) acquisition of total DNA of bacteria in monitoring waters; 2) acquisition of target fragments; 3) construction of standard plasmid; 4) establishment of Q \u2011 PCR quantitative standard curve; 5) determination of Staphylococcus aureus abundance by Q \u2011 PCR technology. The invention shortens the detection time from 2 \u2011 3 days to 1 day of the original method, and only takes 3 \u2011 4 hours when the standard curve is completed, and overcomes the problem that the original method cannot detect the non culturable Enterococcus, and improves the accuracy of identification.
【技术实现步骤摘要】
近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法
本专利技术涉及常见病原菌检测
,涉及到金黄色葡萄球菌保守性基因片段的一种q-PCR检测方法。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为球型直径约0.8um左右,在显微镜下呈单个、成双并且排列成葡萄串状,属于葡萄球菌属,无芽胞和鞭毛,且大多数无荚膜。金黄色葡萄球菌广泛存在自然界中(如空气、水、人和动物的的排泄物等)。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界卫生问题。由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒,占整个细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占到45%,中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生,而随着人类活动对近海水质的影响以及滨海旅游业的发展,金黄色葡萄球菌在海水中引发的卫生问题也越来越受到人们的重视。不过目前对于海水中金黄色葡萄球菌含量的评估主要通过传统的培养计数法(如发酵法、滤膜法、最大可能计数法等),虽然这些方法也可以达到准确计数,但是比较耗时耗力。而对于今后近海水域病原菌的监测的发展带来极大的影响。所以专利技术一种快速、简便、灵敏的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足,提供一种近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法。本专利技术的技术方案如下:近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,包括如下步骤:1)监测海域水环境细菌总DNA的获取通过抽滤方法将一定体积(500ml)海水样品中总细菌全部截留在0.22μm的微孔滤膜上,在-80℃下保存,用WaterDNAKit试剂盒(Omega,USA)提取滤膜上 ...
【技术保护点】
1.近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,其特征在于,包括如下步骤:1)监测海域水环境细菌总DNA的获取;2)目的片段的获取:针对金黄色葡萄球菌特异性耐热核酸酶基因设计特异性引物,目的片段大小约130bp,引物信息如下:上游引物:5′‑CGATTGATGGTGATACGGTT‑3′下游引物:5′‑GCACTTGCTTCAGGACCAT‑3′3)构建标准质粒;4)建立Q‑PCR定量标准曲线:提取完成后用
【技术特征摘要】
1.近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,其特征在于,包括如下步骤:1)监测海域水环境细菌总DNA的获取;2)目的片段的获取:针对金黄色葡萄球菌特异性耐热核酸酶基因设计特异性引物,目的片段大小约130bp,引物信息如下:上游引物:5′-CGATTGATGGTGATACGGTT-3′下游引物:5′-GCACTTGCTTCAGGACCAT-3′3)构建标准质粒;4)建立Q-PCR定量标准曲线:提取完成后用ND-1000UV-VisSpectrophotometer(ThermoFisherScientific,USA)核酸含量测定仪测出质粒的浓度,并用在线计算软件计算出质粒模板的准确拷贝数;对其进梯度稀释,在1.8x103~1.8x107copies/μLcopies/μL范围内建立定量标准曲线;5)环境样品金黄色葡萄球菌数测定:采用Q-PCR技术测定金黄色葡萄球菌丰度。2.根据权利要求1所述的近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,其特征在于,所述步骤1)具体为:通过抽滤方法将海水样品中总细菌全部截留在0.22μm的微孔滤膜上,在-80℃下保存,用WaterDNAKit试剂盒(Omega,USA)提取滤膜上细菌总DNA。3.根据权利要求1所述的近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,其特征在于,所述步骤2)具体为:采用的PCR程序:95℃预变性5min;95℃变性1min,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃终延伸2min;通过普通DNA纯化试剂盒回收纯化PCR产物并获得目的片段。4.根据权利要求1所述的近海水域中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,其特征在于,所述步骤3)具体为构建标准质粒:(ⅰ)纯化的目的...
【专利技术属性】
技术研发人员:汪光义,李佳倩,郭嘉懿,王国柱,
申请(专利权)人:天津大学,
类型:发明
国别省市:天津,12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。