用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法技术

本发明专利技术在常规PCR的基础上引入从堆肥样本中分离得到的耐高温限制酶DFh1，构建了用于特定突变基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法。酶切PCR试剂盒中含有酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmart Buffer。使用酶切PCR扩增时，需要在常规PCR体系的基础上再按每25μl扩增体系中加入1.0μg的酶DFh1和0.25μl的10×CutSmart Buffer进行。所构建的酶切PCR试剂盒和方法可以特异性扩增富集含量低至1%的目标突变基因片段，同时野生型基因片段将无法扩增，从而实现简便高效地富集检测样品中的特定突变基因片段，特别适用于低丰度突变基因片段的富集检测。

Enzyme cut PCR kit and method for specific gene fragment enrichment detection

The invention introduces a high temperature resistant restriction enzyme dfh1 isolated from compost samples on the basis of conventional PCR, and constructs an enzyme cut PCR kit and method for enrichment detection of specific mutated gene segments. The enzyme dfh1 and its buffer are contained in the enzyme digestion PCR kit. The amino acid sequence of the enzyme dfh1 is shown in SEQ No: 2, and the buffer is cutsmart buffer from NEB company of the United States. When using enzyme cut PCR, it is necessary to add 1.0 \u03bc g of enzyme dfh1 and 0.25 \u03bc l of 10 \u00d7 cutsmart buffer into every 25 \u03bc l amplification system on the basis of conventional PCR system. The constructed ELISA PCR kit and method can specifically amplify the target mutant gene fragments with enrichment content as low as 1%, while the wild-type gene fragments will not be amplified, so as to realize the simple and efficient enrichment and detection of specific mutant gene fragments in samples, especially for the enrichment and detection of low abundance mutant gene fragments.

【技术实现步骤摘要】
用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒和方法。
技术介绍
肿瘤是一种基因疾病，基因突变检测对其预防和诊治十分关键。然而由于肿瘤样本中自带大量正常细胞，且只有部分肿瘤细胞会发生特定基因突变（肿瘤的异质性），此外很多关键基因突变在早期本身含量很低，这些导致肿瘤样本中低丰度基因突变的富集检测很有挑战性。PCR技术是基因检测的重要基础，然而常规的PCR技术并不具有选择性扩增癌症样本中突变基因片段的特性，此外扩增产物也往往需要借助其它手段进行分析。因此通过对常规PCR的改进来构建一种选择性扩增低丰度目标突变基因片段的方法就具有十分重要的意义，而本专利技术引入新的具有特殊功能的分子即耐高温限制性内切酶而构建的酶切PCR方法就是其中一种简便有效的方式。限制性核酸内切酶是可以识别双链DNA上特定的核苷酸序列（通常为4到8个核苷酸），并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等因素，可将限制酶分为I、Ⅱ和Ⅲ三种类型。Ⅱ型限制性内切酶（以下简称限制酶）是基因工程中重要的工具酶，其所识别的位置多为短的回文序列，所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。特定的II型限制酶在特定的识别序列切割DNA分子而不会在其它地方切割，精准的切割性能使其在基因重组、基因克隆、质粒构建、DNA片段分析和突变检测等方面应用广泛。目前发现和商品化的限制酶以常温酶为主，极少有耐高温的限制酶，然而耐热型酶由于稳定性良好，因此对于酶的分离纯化、运输存储和活性发挥均具有明显的优势，并且耐高温限制酶在特定领域中具有独特的应用，如在低丰度基因片段（微量等位基因片段和稀有基因突变片段等）的富集和检测中效果显著。申请人取福建省境内普通农田中的牛粪秸秆类高温堆肥开展研究，在其微生态体系蛋白提取液中筛选耐高温即耐热限制酶。首先通过含4核苷酸回文结构区的DNA片段即酶切底物筛选体系获知了堆肥蛋白提取液中含有靶向AGCT位点的耐高温限制酶，接着利用转录组测序和目标基因捕获测序并结合生物信息分析，初步锁定了限制酶的候选编码基因，进行基因克隆和蛋白表达纯化并探究酶切特性，结果检测出了1种含有413个氨基酸的新型耐高温Ⅱ型限制酶DFh1，可以识别5’...AGCT...3’核酸片段的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端，并且酶DFh1具有良好的酶活和耐高温性能。本专利技术获得的新型耐高温Ⅱ型限制酶DFh1可以作为基因工程和基因检测的工具酶，并在低丰度特定基因片段的富集和检测中具有独特的应用。本专利技术在常规PCR的基础上引入新获取的耐高温限制酶DFh1以构建酶切PCR体系，可以特异性扩增富集目标突变基因片段，同时野生型基因片段将无法扩增，从而实现简便高效地富集检测样品中的特定突变基因片段，特别适用于低丰度突变基因片段的富集检测。
技术实现思路
本专利技术提供了新型的可识别5’...AGCT...3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端的耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1，并探究了其酶切特性；在此基础上，将耐高温限制酶DFh1引入常规PCR中构建了特定突变基因片段的简便高效富集检测试剂盒和方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种新型的耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1，该酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，其编码基因序列如SEQIDNO：1所示；DFh1酶可识别5’...AGCT...3’核酸片段中的AGCT回文结构区并在G和C之间进行切割形成平末端。酶DFh1具有良好的酶活，1μg限制酶DFh1在1×CutSmartBuffer缓冲体系和75℃或72℃温度下，在1h内可以将1nmol的含AGCT回文结构区的双链DNA片段（5’-FAM-F15-AGCT-R15-TAMRA-3’）在G和C之间完全酶切形成平末端。此外，限制酶DFh1具有良好的热稳定性，在95℃热育30min，酶活力仍保留90%以上；置于室温下30min，酶活力仍保留99%以上。限制酶DFh1在PCR缓冲液体系中仍能发挥35%以上的酶活。在此基础上，本专利技术的目的在于提供一种用于特定基因片段富集检测的新型酶切PCR检测试剂盒，该试剂盒主要组份包括（1）耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmartBuffer；（2）常规PCR通用组份，主要包括配套的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs；（3）设计用于特异性扩增目标基因片段的常规PCR引物。其中，试剂盒的组份（2）中的常规PCR通用组份，可采购商品化的PCR试剂，包括单独的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs或者这三者的预混液即PCRmix形式。此外，本专利技术还提供了酶切PCR检测试剂盒的使用方法即酶切PCR富集检测方法，主要包括如下步骤：（1）准备好酶切PCR检测试剂盒；（2）配制酶切PCR扩增体系，具体做法是在常规PCR体系的基础上再按每25μl扩增体系中加入1.0μg的酶DFh1和0.25μl的10×CutSmartBuffer获得；（3）在目标基因片段常规PCR扩增条件的基础上延伸时间增加15s以上以及循环数增加5次以上，按照该条件进行酶切PCR；（4）酶切PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中含有目标突变基因片段，没有特异性目标基因片段条带产生则表明样本中不含目标突变基因片段，酶切PCR可以富集检测含量低至1%的目标突变基因片段。其中，试剂盒使用方法中步骤（2）中在配制酶切PCR扩增体系时，先加入相关组份，最终再用灭菌超纯水补足所需的扩增体积。本专利技术提供的基于耐高温限制酶DFh1的酶切PCR方法能够简便有效地富集检测出含量低至1%的特定基因片段，可以广泛应用于基因突变检测等领域中。附图说明图1是5’-FAM-F15-NNNN-R15-TAMRA-3’即含有4核苷酸回文结构区的DNA片段体系的结构示意图，未免大量重复图中含义详见文中表述。图2是目的基因扩增片段电泳图谱，左起第一泳道的DNAMarker从上到下长度分别为2000bp、1000bp、500bp和250bp，第二泳道为反转录扩增体系产物，第二泳道为基因组扩增体系产物。图3是目标基因蛋白表达产物的SDS-PAGE图谱，左起第一泳道的蛋白Marker从上到下分子量分别为50kDa、33kDa、28kDa和19kDa，第二泳道为目标蛋白。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1堆肥蛋白提取液含有耐高温限制酶高温堆肥就是将人粪尿、禽畜粪尿和秸秆等堆积起来，使样本和环境中的细菌和真菌等微生物大量繁殖，细菌和真菌等可以将有机物分解，并且释放出能量形成高温。高温堆肥是生产农家肥料的重要方式，也是分离耐高温微生物和耐高温蛋白的良好来源。取福建省境内普通农田中的牛粪秸秆类高温堆肥样本10份（5g/份），混合均匀后从中取10g，采用德国Qiagen公司的土壤蛋白提取试剂盒（NoviPureSoilProteinExtractionKit），按本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒，其特征在于所述酶切PCR试剂盒主要组份包括（1）耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmart Buffer；（2）常规PCR通用组份，主要包括配套的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs；（3）设计用于特异性扩增目标基因片段的常规PCR引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒，其特征在于所述酶切PCR试剂盒主要组份包括（1）耐高温Ⅱ型限制性内切酶DFh1及其缓冲液，其中酶DFh1的氨基酸序列如SEQNO：2所示，缓冲液选用美国NEB公司的CutSmartBuffer；（2）常规PCR通用组份，主要包括配套的耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和底物dNTPs；（3）设计用于特异性扩增目标基因片段的常规PCR引物。2.如权利要求1中所述的一种用于特定基因片段富集检测的酶切PCR试剂盒的使用方法，其特征在于酶切PCR富集检测方法主要包括如下步骤：（1）准备好...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄种山，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：福建晨欣科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35