一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，涉及生物医学技术领域，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。本发明专利技术所述的检测基因突变的方法与传统的SNP位点检测技术相比，可以在一个反应中实现多个SNP位点的检测，具有较高的应用价值。

A method to detect the mutation site of vitamin A metabolism related gene

The invention discloses a method for detecting the mutation site of vitamin A metabolism related gene, which relates to the field of biomedical technology. The target segment is obtained by the single tube multiple PCR amplification reaction of the designed target site-specific primer, the target segment is digested by the restriction endonuclease, and then the target segment digested by the restriction endonuclease is bidirectional by the single base extension technology Extending, obtaining the gene site to be detected, and finally accurately determining the target DNA sequence through nucleic acid mass spectrometry analysis; wherein, the single base extension technology adopts the single base extension primer group to extend the target fragment in two directions. Compared with the traditional SNP site detection technology, the method for detecting gene mutation of the invention can realize the detection of multiple SNP sites in one reaction, and has higher application value.

【技术实现步骤摘要】
一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法
本专利技术涉及生物医学
，特别是涉及一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法。
技术介绍
维生素A(vitaminA)又称视黄醇(其醛衍生物视黄醛)或抗干眼病因子，是一个具有脂环的不饱和一元醇，包括动物性食物来源的维生素A1、A2两种，是一类具有视黄醇生物活性的物质。维生素A维持正常视觉功能，维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成，维持骨骼正常生长发育，抑制肿瘤生长等，但是过量摄入维生素A可引起头痛、皮肤干燥、脱屑和脱发等症状。BCM01是类胡萝卜素转化成视黄醇过程中的一个关键酶，BCM01基因的多态性影响维生素A的转化效率，从而影响该营养素正常需求。BCM01基因多态性的筛查能帮助个体充分了解自己的遗传状况，提前采取相应的健康管理措施。BCM01基因多态性的筛查一般采用传统的SNP位点检测技术，该技术一次只能对一个基因进行检测，对于需要检测多种基因来说，该方式存在工作量大且效率低的问题。
技术实现思路
为了传统的SNP位点检测技术存在的一次只能对一个基因进行检测，对于需要检测多种基因来说，该方式存在工作量大且效率低的问题；本专利技术提供了一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法。本专利技术所采用的技术方案为：一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。在其中一个实施例中，所述目标位点特异性引物包括：用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6420424片段的第一特异性引物，第一特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：1所示，第一特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：2所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS11645428片段的第二特异性引物，第二特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：3所示，第二特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：4所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6564851片段的第三特异性引物，第三特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：5所示，第三特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：6所示。在其中一个实施例中，所述单碱基延伸技术所用的引物包括：用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6420424片段的第一单碱基延伸引物，第一单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQIDNos：7所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS11645428片段的第二单碱基延伸引物，第二单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQIDNos：8所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6564851片段的第三单碱基延伸引物，第三单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQIDNos：9所示。在其中一个实施例中，在第一单碱基延伸引物的5`端、第二单碱基延伸引物的5`端以及第三单碱基延伸引物的5`端均加入10个核苷酸，10个核苷酸的固定序列为ACGTTGGATG。在其中一个实施例中，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃2分钟，95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保温。在其中一个实施例中，所述限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。在其中一个实施例中，所述限制性内切酶消化处理的程序为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。在其中一个实施例中，所述双向延伸反应的程序为：94℃30秒；94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒，5个循环，40个循环；72℃3分钟，4℃保温。在其中一个实施例中，所述核酸质谱分析的具体步骤为：所述核酸质谱分析的具体步骤为：S1：在树脂板上铺好待用树脂，风干3-8分钟；S2：向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充41μLddH2O，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬时离心；S3：除去封口膜，将样本板倒扣在步骤S1中的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬时离心；S4：将步骤S3中的样本板置于旋转器上在800rpm/min的转速下旋转30分钟，在3000rpm/min，离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，然后再利用单碱基延技术，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列。本专利技术所述的检测基因突变的方法与传统的SNP位点检测技术相比，可以在一个反应中实现多个SNP位点的检测，具有较高的应用价值。附图说明图1是实施例1中人类维生素A代谢相关基因BCM01-RS6420424的核酸质谱分析图；图2是实施例1中人类维生素A代谢相关基因BCM01-RS11645428的核酸质谱分析图；图3是实施例1中人类维生素A代谢相关基因BCM01-RS6564851的核酸质谱分析图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步阐述。下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。在本专利技术的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本专利技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。本专利技术的描述中，有的结构或器件未作具体描述的，理解为现有技术中有能实现的结构或器件。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。以下结合具体实施例对本专利技术作进一步阐述。实施例1一种人类维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，包括以下步骤：1.提取血液样本DNA1.1将离心管中的500ul血液样品10000rpm离心2min，去除上清液，留沉淀备用；1.2向上述离心管中加入350μLBufferMCL和20μLProteinaseK，震荡混匀，65℃水浴20min，间或混匀；1.3水浴完成之后向离心管中加入350μLBufferMA和25μLSanMagBeads，振荡或者颠倒混匀，室温静置3min，间或混匀；1.4将离心管置于磁力架上30s，待SanMagBeads完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管；1.5向离心管中加入700μL70％乙醇，吸打或者点振混匀，将离心管置于磁力架上30s，吸弃上清，从磁力架上取出离心管；1.6重复步骤1.5一次，室温开盖干燥10min至管内无液体残留；1.7向离心管中加入50μLTEBuffer(pH8.0)，间或混匀；1.8取出离心管并置于磁力架上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。

【技术特征摘要】
1.一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列；其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。2.根据权利要求1所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述目标位点特异性引物包括：用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6420424片段的第一特异性引物，第一特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：1所示，第一特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：2所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS11645428片段的第二特异性引物，第二特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：3所示，第二特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：4所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6564851片段的第三特异性引物，第三特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：5所示，第三特异性引物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNos：6所示。3.根据权利要求1所述的维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述单碱基延伸技术所用的引物包括：用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6420424片段的第一单碱基延伸引物，第一单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQIDNos：7所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS11645428片段的第二单碱基延伸引物，第二单碱基延伸引物的核苷酸序列如SEQIDNos：8所示；用于扩增维生素A代谢相关基因BCM01-RS6564851片段的第三单碱基延伸引物，第三单碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立波，张宇，
申请(专利权)人：杭州云鼎基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33