产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法。本发明专利技术已从传统发酵的豆豉中筛选出的天然的产纳豆激酶、蛋白酶、β‑葡萄糖苷酶、淀粉酶等多酶新菌株，利用该菌株来发酵黄豆制备纳豆，制备获得的纳豆具有预防心脑血管疾病、助消化和转化银杏黄酮苷等功能；同时提供了一种新的同时生产纳豆激酶、蛋白酶、β‑葡萄糖苷酶、淀粉酶的培养方法，且安全性高；由于黄豆来源广泛，价格适中，降低纳豆激酶、蛋白酶、β‑葡萄糖苷酶、淀粉酶的生产成本；另外提供了一种从豆豉中提取纳豆激酶的简单纯化方法。因此该解淀粉芽孢杆菌具有很好的应用前景。

Gutu06, a strain of Bacillus amylolyticus producing many enzymes and its screening method

The invention discloses a strain gutu06 of Bacillus amylolyticus producing a variety of enzymes and a screening method thereof. The invention has screened out natural nattokinase, protease, \u03b2 - glucosidase, amylase and other multi enzyme new strains from the traditional fermented Douchi, which are used to ferment soybeans to prepare nattokinase, and the nattokinase obtained has the functions of preventing cardiovascular and cerebrovascular diseases, assisting digestion and transforming gingko flavonoid glycoside, and at the same time provides a new simultaneous production of Nattokinase and protein The culture method of enzyme, \u03b2 - glucosidase and amylase has high safety; due to the wide source and moderate price of soybean, the production cost of nattokinase, protease, \u03b2 - glucosidase and amylase is reduced; in addition, a simple purification method of nattokinase extracted from Douchi is provided. Therefore, the Bacillus amylolyticus has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法
本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法。
技术介绍
纳豆是一种传统的发酵豆制食品，通过用枯草芽孢杆菌发酵大豆而制备，具有独特的风味和粘性。在纳豆发酵和后熟过程中，产生了如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、糖化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶等多种酶类，这些酶类的存在和作用显著地影响着纳豆的风味和品质。其中，在蛋白酶的作用下，大豆蛋白被降解为较小的氮化合物，例如肽、氨基酸、胺和氨类物质，不仅增强其营养性，使人体更易吸收，同时这些小分子化合物含量的增加使其风味更突出。同时，淀粉酶水解大豆中的淀粉生成糊精、麦芽糖，最终生成葡萄糖，葡萄糖经发酵,又可产生多种低分子物质，如乙醇、乙醛、乙酸、乳酸等，这些物质既是形成纳豆风味的组分，又可与其他物质作用生成色素及酷类等香气成分。β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶类，它能够参与生物体的糖代谢，在纳豆发酵中，不利于人体的消化吸收的大豆异黄酮经β-葡萄糖苷酶催化水解可转化成为高活性的大豆异异黄酮苷元，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。在微生物及各种酶类的相互作用下，大豆成分被分解产生各类活性物质，使纳豆成为具有多种生理活性的功能性保健食品。纳豆激酶-纳豆中最重要的一种活性物质，是一种丝氨酸蛋白酶。据报道，纳豆激酶已经被证明是体外和体内有效的血栓溶解酶。作为一种天然发酵产物，与临床使用的溶栓药物相比，纳豆激酶在治疗各种血栓血管疾病方面具有更优越的有效性和安全性，在胃肠道中足够稳定使得该酶成为口服溶栓治疗的有用药剂，此外，它还有治疗高血压，阿尔茨海默病和玻璃体视网膜疾病的巨大潜力。纳豆激酶是微生物代谢产物，只要生产菌株活性稳定，工艺成熟即可实现大规模生产，且具有发酵纳豆激酶的原料来源广、生产周期短、产量高、价格低廉和易于提取等优势，使其开发前景广阔。而固态发酵与液体发酵相比，成本低、酶活力高、酶系丰富、设备操作简单、易于企业扩大化生产且产率高，因此，国内外食品发酵工业化生产普遍采用这种工艺。发酵后的产品不仅可用作食品直接食用，还可以通过进一步的分离纯化，制成不同类型和纯度的纳豆激酶胶囊。由于纳豆激酶来源于食品级微生物及其奇特功能，国内外很多学者对纳豆和含纳豆激酶的保健食品进行了深入开发。但是，因为发酵菌株及发酵工艺的问题，纳豆具有的不愉快气味及口感使得世界范围上多数人们难以接受。目前，许多研究人员将突破点放在对纳豆激酶菌株的分离筛选上，志在筛选出具有高效溶栓效果、发酵纳豆感官性能良好且功能性丰富的优秀纳豆发酵菌株，以期为预防心脑血管疾病保健品及纳豆激酶的工业化生产做出贡献。此外，由于纳豆激酶是胞外酶，其生产都来自于微生物的发酵，因而粗酶液含有较多杂质、纳豆激酶纯度低而不能大规模生产应用，所以将纳豆激酶从粗酶液中分离提纯得到纯度较高的酶制剂就显得十分关键。目前常用来纯化纳豆激酶的方法有盐析、超滤、层析过滤或凝胶过滤，这些方法大都存在着方法繁琐、回收率低、不利于保持酶活力和无法大规模生产等问题。而采用新型的纯化方法，如膜分离法、免疫纯化、反胶束萃取、高效液相色谱和双水相萃取的方法较少。其中，反胶束萃取在分离和提纯上具有很多优点，如提取生物分子时选择性高并且它不影响生物分子活性、而且具有体系黏度低、反萃过程中分相的时间短、连续生产相对容易、节约成本(如表面活性物质可以循环再利用)等。反胶束萃取技术一般包括前萃取和反萃取(也有研究者称为后萃)两个过程，它的主要原理是液-液萃取。国内鲜有将反胶束萃取运用在纤溶酶纯化上，只有刘俊果等采用AOT/异辛烷作为反胶团萃取体系，从发酵液萃取纯化纳豆激酶，酶活力回收率达到80％，纯化因子约为2.5左右。但是，单一的方式提纯的纳豆激酶纯度有限，纳豆激酶中仍然存在其他杂质，而科学研究中及生产使用中对纳豆激酶的纯度有所要求。此外，国内目前没有将反胶束萃取与其他酶纯化技术结合来纯化纳豆激酶的报道，因此，找出一套合适的纳豆激酶纯化技术尤为重要。β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，是一类来源广泛的水解酶类。其特性是可水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶可由酵母，曲霉、木霉、细菌等产生。根据国内外的报道，该酶可广泛用于黄酮类物质的生物转化。微生物发酵产酶是生物酶来源的一个有效途径。国内外的研究表明，通过微生物发酵产酶能够水解银杏黄酮苷成银杏黄酮苷元，使苷元活性明显高于银杏黄酮苷。银杏黄酮是目前已发现的最好的防治心脑血管疾病的药物，当前银杏黄酮主要是从银杏叶中提取的，不过从银杏叶中提前的银杏黄酮主要是以银杏黄酮苷的形式存在，而而银杏黄酮苷的生物活性要显著小于银杏黄酮苷元，由于酶法环境友好选择性高，因此有必要利用β-葡萄糖苷酶把银杏黄酮苷转化为苷元。蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。在食品工业中应用广泛。此外蛋白酶也有助于人体消化可把人体摄入的蛋白质被水解成小分子肽和氨基酸。因此蛋白酶开发生产具有重要意义。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷键的酶。淀粉酶是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶也可有助于人体消化。目前对产纳豆激酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和淀粉酶的微生物有较多报道，但同时产这几种酶的单菌用来开发纳豆食品还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06及其筛选方法，。本专利技术是这样实现的：产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06，其微生物学分类命名为解淀粉芽孢杆菌GUTU06，拉丁文学名Bacillusamyloliquefaciens.GUTU06，保藏编号为CCTCCM2019234。解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06的筛选方法，包括如下步骤：1)利用酪蛋白培养基分离豆豉中的产蛋白酶的芽孢杆菌；2)将步骤1)分离获得的芽孢杆菌进行黄豆固体发酵制备豆豉，对发酵结果进行感官鉴评，选出感官鉴评良好的菌株；3)将步骤2)中选出的菌株划线接种到酪蛋白平板培养基上，在37℃培养活化24h，活化两次后，挑取透明圈较大的单菌落接种到液体种子液培养基中，于37℃、180r/min培养18h后，得到发酵种子液；按质量百分比4％的接种量接种到黄豆固态培养基中，37℃下发酵24h；将培养完成的纳豆按照质量比为1:9加入水中均质后，在4℃浸提24h后，于4℃、12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液；然后通过外分光光度法检测纳豆激酶活力，福林法检测其蛋白酶活力，DNS法检测其淀粉酶活力，DNS法检测β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活力，选出蛋白酶、纳豆激酶、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶的综合指数最高、且发酵纳豆感官性能良好的菌株，即为解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06。步骤1)中所述的酪蛋白培养基的组成为：3-10g/L酪素，1-5g/L葡萄糖，0.5-1.5g/L酵母膏，1-5g/LK2HPO4，0.5-2.5g/LKH2PO4，0.1-0.5g/LMgSO4，pH7.0～7.2。步骤2)中所述的制备豆豉所用的培养基的制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06，其特征在于：其微生物学分类命名为解淀粉芽孢杆菌GUTU 06，拉丁文学名Bacillus amyloliquefaciens.GUTU 06，保藏编号为CCTCC M 2019234。

【技术特征摘要】
1.一种产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06，其特征在于：其微生物学分类命名为解淀粉芽孢杆菌GUTU06，拉丁文学名Bacillusamyloliquefaciens.GUTU06，保藏编号为CCTCCM2019234。2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1)利用酪蛋白培养基分离豆豉中的产蛋白酶的芽孢杆菌；2)将步骤1)分离获得的芽孢杆菌进行黄豆固体发酵制备豆豉，对发酵结果进行感官鉴评，选出感官鉴评良好的菌株；3)将步骤2)中选出的菌株划线接种到酪蛋白平板培养基上，在37℃培养活化24h，活化两次后，挑取透明圈较大的单菌落接种到液体种子液培养基中，于37℃、180r/min培养18h后，得到发酵种子液；按质量百分比4％的接种量接种到黄豆固态培养基中，37℃下发酵24h；将培养完成的纳豆按照质量比为1:9加入水中均质后，在4℃浸提24h后，于4℃、12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液；然后通过外分光光度法检测纳豆激酶活力，福林法检测其蛋白酶活力，DNS法检测其淀粉酶活力，DNS法检测β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活力，选出蛋白酶、纳豆激酶、β-葡萄糖苷酶和淀粉酶的综合指数最高、且发酵纳豆感官性能良好的菌株，即为解淀粉芽孢杆菌菌株GUTU06。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：步骤1)中所述的酪蛋白培养基的组成为：3-10g/L酪素，1-5g/L葡萄糖，0.5-1.5g/L酵母膏，1-5g/LK2HPO4，0.5-2.5g/LKH2PO4，0.1-0.5g/LMgSO4，pH7.0～7.2。4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：步骤2)中所述的制备豆豉所用的培养基的制备方法是，将黄豆洗净后，将洗净的黄豆与水按照1:3-5单位g/mL的料液比进行常温浸泡，浸泡10-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：何腊平，兰光群，李翠芹，杨运，黄露，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52