南极来源的产低温几丁质酶菌株及其发酵方法技术

本发明专利技术提供了一种南极来源的产低温几丁质酶菌株及其发酵方法。本发明专利技术的菌株称为Pseudomonas sp.GWSMS‑1，简称GWSMS‑1，其保藏号为CCTCC NO:M2019207。本发明专利技术的菌株生产的几丁质酶可在低温下保存，具有良好的低温活性。本发明专利技术人还通过进一步优化提高了该菌株的几丁质酶产量。本发明专利技术的GWSMS‑1菌株及其培养物、代谢产物、培养上清或裂解产物具有很好的工业应用前景。

Chitinase Producing Strains from Antarctica and their fermentation methods

The invention provides a Chitinase Producing Strain from Antarctic source and a fermentation method thereof. The strain of the invention is called Pseudomonas sp. gwsms \u2011 1, referred to as gwsms \u2011 1, and its deposit number is CCTCC No: m2019207. The Chitinase Produced by the strain of the invention can be preserved at low temperature and has good low temperature activity. The invention also improves the chitinase output of the strain through further optimization. The gwsms \u2011 1 strain of the invention and its culture, metabolite, culture supernatant or lysate have good industrial application prospects.

【技术实现步骤摘要】
南极来源的产低温几丁质酶菌株及其发酵方法
本专利技术属于微生物学、生物化学、发酵工程等领域，更具体地，本专利技术涉及一种假单胞菌属的南极海洋细菌，特别是一种产低温几丁质酶的菌株及其发酵方法研究。该专利技术的菌株生产的低温几丁质酶主要应用于发酵、医药、食品、农业等行业。
技术介绍
几丁质，又称甲壳素，是由N-乙酰葡萄糖胺单体以β-1,4糖苷键连接而成的直链多糖，广泛存在于甲壳动物外骨骼、昆虫体表、真菌细胞壁、藻类等生物体中，自然界中几丁质的存在量仅次于纤维素，是第二大可再生资源。几丁质根据其分子长链的排列方式可分为α型几丁质、β型几丁质和γ型几丁质。α型几丁质是主要的存在形式，由N-乙酰葡萄糖胺以反向平行的方式线性排列而成，β型几丁质是由两条同向平行链排列形成的，而γ型几丁质则是由3条链组成，两条同向，一条反向。几丁质酶是一大类可水解几丁质的糖苷水解酶的统称。广泛存在于生物体中，如细菌、真菌、酵母、植物、放线菌、节肢动物和人类等。根据几丁质酶作用时的切割位点不同，可将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶两大类。内切几丁质酶在几丁质内部随机切割，外切几丁质酶可催化几丁质从非还原性末端释放二乙酰壳二糖，以及可以分解内切几丁质酶产生的低聚物。几丁质酶降解几丁质后得到的产物壳寡糖具有抗菌、调节凝血等功能，临床上可用于止血敷料。几丁质酶还具有抗真菌活性，在治疗真菌性疾病时，可增加抗真菌药物的抗性或者作为杀虫剂和抗真菌剂应用于农业上。此外，几丁质酶还可用作食品防腐剂延长食品的保质期。当几丁质酶被用于抑制病原微生物或昆虫时，由于微生物细胞壁或昆虫体表中存在的几丁质构型不同，往往需要具有不同底物特异性的几丁质酶来切割不同构型的几丁质。不同几丁质酶生产菌株对于人工培养、发酵的适应性和要求不同，且产生的几丁质酶产物在性能上一般不相同，从而能够酶切的底物常常也存在不同。本领域的实践应用中，有的菌株产生的含酶产物尽管测定时有理论酶活但其却在实际应用方面不够理想，例如抑菌效果并不理想；也有的菌株产生的含酶产物当利用常规人工底物(通常链较短)测酶活时效果优异，但是当分解天然几丁质或胶体几丁质(通常为长链)时酶活则非常低。因此，本领域亟待筛选和开发高效生产几丁质酶、且所产生的含酶产物具有实际应用价值的菌株，确保其在更广泛的领域或更大的规模下被应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能生产低温几丁质酶的新菌种，并提供该菌种的分离培养和发酵方法。在本专利技术的第一方面，提供一种经分离的几丁质酶生产菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019207。在一个优选例中，所述菌株为假单胞菌属(Pseudomonassp)的菌株。在另一优选例中，该菌株的16SrDNA全基因碱基序列如SEQIDNO:1。在另一优选例中，所述的几丁质酶是低温几丁质酶。在另一优选例中，所述菌株为适应低盐环境或淡水环境的菌株。在另一优选例中，所述的低盐为含盐量0～2％，较佳地低于1.5％，更佳地低于1％或低于0.5％。在本专利技术的另一方面，提供所述的几丁质酶生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：(a)含有几丁质酶；(b)水解几丁质；(c)具有抑制病原微生物或杀虫能力。在本专利技术的另一方面，提供所述的几丁质酶生产菌株的应用，用于：(1)生产几丁质酶；或(2)制备细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：(a)含有几丁质酶；(b)水解几丁质；和/或(c)具有抑制病原微生物或杀虫能力。在本专利技术的另一方面，提供所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于抑制病原微生物或杀虫，或用于制备具有抑制病原微生物或杀虫能力的组合物。在本专利技术的另一方面，提供一种组合物，其包含选自下组的成分：前面所述的几丁质酶生产菌株；或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。在另一优选例中，所述的组合物包括但不限于：医药组合物、保健品组合物、食品组合物、农药学组合物、饲料组合物等。在另一优选例中，所述的组合物还包含：工业学上可接受的载体，或微生物学上可接受的载体。在本专利技术的另一方面，提供一种应用所述的几丁质酶生产菌株生产几丁质酶的方法，包括：在以下条件培养所述几丁质酶生产菌株：在低盐或淡水中培养；以葡萄糖、甘露糖或核糖作为碳源，较佳地以葡萄糖作为碳源；以蛋白胨作为氮源；添加5～20g/L几丁质；添加0.2～5mM镁离子；温度10～40℃、较佳地15～25℃、更佳地15～22℃；pH6.2～7.5、较佳地pH6.5～7.3、更佳地pH6.5～7.2；转速50～300rpm、较佳地100～250rpm、更佳地100～150rpm；培养时间4～7天、较佳地5～6.5天。在另一优选例中，所述的方法中，碳源葡萄糖的浓度为15±5g/L、较佳地15±2g/L；蛋白胨的浓度为1±0.5g/L、较佳地1±0.2g/L；几丁质的浓度为15±5g/L、较佳地15±2g/L；镁离子的浓度为1±0.5mM、较佳地1±0.2mM。在本专利技术的另一方面，提供一种抑制病原微生物或杀虫的方法，所述方法包括：以所述的几丁质酶生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物对需要抑制病原微生物或杀虫的对象进行处理。在另一优选例中，所述的病原微生物包括(但不限于)：真菌；较佳地所述真菌包括(但不限于)：VerticilliumdahliaCICC2534，Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumCICC2532，AspergillusnigerCICC2039，PenicilliummacrosclerotiorumCICC40649。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、Pseudomonassp.GWSMS-1产酶时间曲线。图2、Pseudomonassp.GWSMS-1产几丁质酶的各种优化。(a)氮源的优化考察；(b)碳源的优化考察；(c)氮源浓度的优化考察；(d)碳源浓度的优化考察；(e)几丁质浓度的优化考察；(f)发酵pH的优化考察；(g)发酵温度的优化考察；(h)摇床转速的优化考察。图3、几丁质酶粗酶性质。(a)最适反应温度试验；(b)温度稳定性试验；(c)最适pH试验；(d)pH稳定性试验。图4、抗真菌实验结果图。具体实施方式本专利技术人通过大规模筛选，获得了一株生产几丁质酶的菌株，称为Pseudomonassp.GWSMS-1(简称GWSMS-1)，保藏号为CCTCCNO:M2019207。本专利技术的菌株生产的几丁质酶，可在低温下生存，具有良好的低温活性。本专利技术人还通过进一步优化提高了该菌株的几丁质酶产量。本专利技术的GWSMS-1菌株及其培养物、代谢产物、培养上清或裂解产物具有很好的工业应用前景。术语如本文所用，术语“几丁质酶生产菌株”，“Pseudomonassp.GWSMS-1”、“GWSMS-1”可互换使用，都指保藏号为CCTCCNO:M2019207的假单胞菌属的菌株。如本文所用，术语“病原微生物”是指所述的有害微生物，所述有害微生物包括各种菌如细菌、真菌或放线菌等。如本文所用，术语“杀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经分离的几丁质酶生产菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019207。

【技术特征摘要】
1.一种经分离的几丁质酶生产菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2019207。2.如权利要求1所述的几丁质酶生产菌株，其特征在于，该菌株为假单胞菌属(Pseudomonassp)的菌株；或该菌株的16SrDNA全基因碱基序列如SEQIDNO:1；或所述的几丁质酶是低温几丁质酶；或该菌株为适应低盐环境或淡水环境的菌株。3.权利要求1～2任一所述的几丁质酶生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：(a)含有几丁质酶；(b)水解几丁质；(c)具有抑制病原微生物或杀虫能力。4.权利要求1～2任一所述的几丁质酶生产菌株的应用，用于：(1)生产几丁质酶；或(2)制备细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：(a)含有几丁质酶；(b)水解几丁质；和/或(c)具有抑制病原微生物或杀虫能力。5.权利要求3所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于抑制病原微生物或杀虫，或用于制备具有抑制病原微生物或杀虫能力的组合物。6.一种组合物，其包含选自下组的成分：权利要求1～2任一所述的几丁质酶生产菌株；或权利要求3所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。7.一种应用权利要求1～2任一所述的几丁质酶生产菌株生产几丁质酶的方法，包括：在以下条件培养所述几丁质酶生...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁海涛，陈波，俞勇，廖丽，刘克振，
申请(专利权)人：中国极地研究中心中国极地研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31