一种忍冬提取物的提取方法及其应用技术

本发明专利技术涉及活性物质的提取方法，特别涉及一种忍冬提取物的提取办法及其应用。提取物为将忍冬为原料依次经醇提、旋蒸进行提取，而后经甲醇溶解。本发明专利技术通过实验证实了忍冬抗肿瘤活性成分(LJ‑3)能够抑制人宫颈癌细胞系SiHa细胞，Hela细胞和Caski细胞的增殖。由本发明专利技术的方法提取得到的忍冬抗肿瘤活性物质，具有明显的抗肿瘤活性作用，对于肿瘤疾病的治疗提供了一种新的技术手段。

Extraction method and application of extract from Lonicera japonica

【技术实现步骤摘要】
一种忍冬提取物的提取方法及其应用
本专利技术涉及活性物质的提取方法，特别涉及一种忍冬提取物的提取方法及其应用。
技术介绍
忍冬是具有悠久历史的常用中药之一，又名金银花、鹭鸳花、银花、金藤花、双苞花等。忍冬有非常久的使用历史，始见于李时珍的“本草纲目”，而且药用价值和保健用途非常广泛，已被“中国药典”收录。其功效主要是清热解毒，消炎退肿，外感风热或温病发热，中暑，热毒血痢，痈肿疔疮，喉痹，多种感染性疾病等。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病原因多样化，但是90％以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染。现有癌症尤其是宫颈癌临床治疗办法主要为手术，放疗和化疗等办法。手术对病人的身体和心理的产生的伤害非常巨大，难以恢复；放疗的适用性较差，较大的实体瘤和大面积的照射都不适用，且容易造成感染；而一般的化疗药物都存在一定的细胞毒性，对消化系统，骨髓功能及肝肾功能都有较大的损伤，并且极易产生耐药性。因此需要提供一种特异性较高，毒副作用小，经济实惠并且抗肿瘤效果好的药物来改善或解决目前宫颈癌治疗的问题。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种忍冬提取物及其提取物和应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种忍冬提取物，以忍冬为原料依次经醇提、旋蒸进行提取，而后经甲醇溶解即得忍冬提取物。进一步的说：1)醇提：将忍冬经筛除尘，而后经过量的无水乙醇与75％乙醇交替多次浸泡，浸泡后经超声破碎，过滤，收集滤液，待用；2)旋蒸：将上述收集的滤液置于4℃过夜，自然沉淀，取上清过滤，然后经真空旋转蒸发，将蒸发后物质用10％的甲醇溶液溶解，即得忍冬提取物。所述步骤1)取忍冬经筛除尘，除尘后用自来水清洗3-6遍，再用蒸馏水洗2-4遍，清洗后将其浸泡至过量的无水乙醇或75％乙醇中，交替浸泡3-4次，而后将浸泡液混合，过滤，置4℃冰箱保存备用；其中，一次交替浸泡为将忍冬浸泡至过量的无水乙醇中超声浸泡0.5-1h，而后取出忍冬再置于过量的75％乙醇中进行超声浸泡0.5-1h。所述醇提过滤为真空抽滤；所述真空旋转蒸发为于40-45℃水浴，真空条件下旋转蒸发4-5h；所述旋蒸过滤为用0.22um的滤膜进行无菌过滤。一种忍冬提取物的提取方法：1)醇提：将忍冬经筛除尘，而后经过量的无水乙醇与75％乙醇交替多次浸泡，浸泡后经超声破碎，过滤，收集滤液，待用；2)旋蒸：将上述收集的滤液置于4℃过夜，自然沉淀，取上清过滤，然后经真空旋转蒸发，将蒸发后物质用10％的甲醇溶液溶解，即得忍冬提取物。所述步骤1)取忍冬经筛除尘，除尘后用自来水清洗3-6遍，再用蒸馏水洗2-4遍，清洗后将其浸泡至过量的无水乙醇或75％乙醇中，交替浸泡3-4次，而后将浸泡液混合，过滤，置4℃冰箱保存备用；其中，一次交替浸泡为将忍冬浸泡至过量的无水乙醇中超声浸泡0.5-1h，而后取出忍冬再置于过量的75％乙醇中进行超声浸泡0.5-1h。所述真空旋转蒸发为于40-45℃水浴，真空条件下旋转蒸发4-5h；所述旋蒸过滤为用0.22um的滤膜进行无菌过滤。一种忍冬提取物的应用，所述提取物作为制备抗肿瘤制剂中的应用。所述肿瘤为宫颈癌，肺癌或肝癌。本专利技术做具有的优点：本专利技术以我国资源丰富，价格便宜，毒副作用低且易于普及的中草药忍冬(即金银花)为原料，对其进行分离、提取，得到忍冬抗肿瘤活性物质(LJ-3)，该提取物(LJ-3)，经一系列的抗肿瘤活性测定，证实其具有体外抑制人宫颈癌细胞系SiHa细胞，Hela细胞和Caski细胞增殖的作用。LJ-3作用于SiHa细胞72h半数抑制浓度(IC50)为16.477μg/ml，由此可见忍冬抗肿瘤活性物质(LJ-3)是一种强的抗肿瘤活性物质。同时，忍冬抗肿瘤活性物质(LJ-3)作用细胞48h后停止给药，继续培养细胞发现其抑制增殖的作用与持续给药近似，因此，忍冬抗肿瘤活性物质(LJ-3)还是一种长效的抗肿瘤活性物质。根据四株宫颈癌细胞系HPV感染的情况，可见忍冬抗肿瘤活性物质(LJ-3)对HPV阳性的宫颈癌细胞系(Siha细胞，Caski细胞，Hela细胞)有较强的抑制作用，而对HPV阴性的宫颈癌细胞基本没有抑制作用。附图说明图1为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测忍冬作用96h后SiHa细胞增殖的抑制率图；图2为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测顺铂作用96h后SiHa细胞增殖的抑制率图；图3为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测忍冬作用48h后停止给药的SiHa细胞增殖的抑制率图；图4为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测未经药物作用的SiHa细胞在96h内的增殖曲线；图5为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测忍冬作用96h后C33A细胞增殖的抑制率图；图6为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测未经药物作用的C33A细胞在96h内的增殖曲线；图7为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测忍冬作用96h后Hela细胞增殖的抑制率图；图8为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测未经药物作用的Hela细胞在96h内的增殖曲线；图9为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测忍冬作用96h后Caski细胞增殖的抑制率图；图10为本专利技术实施例提供的采用MTT法检测未经药物作用的Caski细胞在96h内的增殖曲线；图11为本专利技术实施例提供的采用qPCR实验检测宫颈癌细胞系SiHa细胞的HPV感染情况图；图12为本专利技术实施例提供的采用qPCR实验检测宫颈癌细胞系HeLa细胞的HPV感染情况图；图13为本专利技术实施例提供的采用qPCR实验检测宫颈癌细胞系CasKi细胞的HPV感染情况图；图14为本专利技术实施例提供的采用qPCR实验检测宫颈癌细胞系C33A细胞的HPV感染情况图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术精神和范围下可以对本专利技术的技术方案和细节形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术保护的范围内。实施例1：1)忍冬醇提液的制备取忍冬(购买自天益堂药房，产地河南)30g经过筛除尘后，忍冬经过筛除尘称重后，将其浸泡至过量的无水乙醇中浸泡0.5h，浸泡后再转移至过量的75％乙醇中浸泡0.5h实现交替浸泡，浸泡后超声破碎1h，重复交替浸泡和超声共3次，过滤，收集滤液500ml，置于500ml蓝盖试剂瓶中，标记为LJ-1，置4℃冰箱保存备用。2)忍冬过滤液的制备取500ml忍冬醇提液LJ-1置于4℃过夜，自然沉淀，取上清经过定性滤纸真空抽滤后，将滤液置于新500ml蓝盖试剂瓶中，标记为LJ-2。3)忍冬抗肿瘤活性成分甲醇溶液的制备取500mlLJ-2，置于圆底烧瓶中，经真空旋转蒸发仪在40℃水浴，真空的条件下旋转蒸发4h左右，直至圆底烧瓶中剩余少量液体时，停止加热，利用余热蒸干，用药匙将黏在圆底烧瓶内壁的粉末轻轻刮下至15ml离心管中，称重为12mg，将所得粉末用10ml10％的甲醇溶液溶解粉末并经过0.22um滤膜的无菌过滤，记为LJ-3，保存在4℃。实施例2：忍冬抗肿瘤活性物质(LJ-3)体外抑制人宫颈癌细胞系SiHa细胞增殖作用将上述实施例获得提取物(LJ-3)采用MTT比色法体外对人宫颈癌SiHa细胞生长、增殖的抑制进行检测：采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种忍冬提取物，其特征在于：以忍冬为原料依次经醇提、旋蒸进行提取，而后经甲醇溶解即得忍冬提取物。

【技术特征摘要】
1.一种忍冬提取物，其特征在于：以忍冬为原料依次经醇提、旋蒸进行提取，而后经甲醇溶解即得忍冬提取物。2.按权利要求1所述的忍冬提取物，其特征在于：1)醇提：将忍冬经筛除尘，而后经过量的无水乙醇与75％乙醇交替多次浸泡，浸泡后经超声破碎，过滤，收集滤液，待用；2)旋蒸：将上述收集的滤液置于4℃过夜，自然沉淀，取上清过滤，然后经真空旋转蒸发，将蒸发后物质用10％的甲醇溶液溶解，即得忍冬提取物。3.按权利要求2所述的忍冬提取物，其特征在于：所述步骤1)取忍冬经筛除尘，除尘后用自来水清洗3-6遍，再用蒸馏水洗2-4遍，清洗后将其浸泡至过量的无水乙醇或75％乙醇中，交替浸泡3-4次，而后将浸泡液混合，过滤，置4℃冰箱保存备用；其中，一次交替浸泡为将忍冬浸泡至过量的无水乙醇中超声浸泡0.5-1h，而后取出忍冬再置于过量的75％乙醇中进行超声浸泡0.5-1h。4.按权利要求2所述的忍冬提取物，其特征在于：所述醇提过滤为真空抽滤；所述真空旋转蒸发为于40-45℃水浴，真空条件下旋转蒸发4-5h；所述旋蒸过滤为用0.22um的滤膜进行无菌过滤。5.一种按权利要求1所述的忍冬提取物的提取方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹宇，田柳，林洋，郭海燕，温馨，
申请(专利权)人：胤安国际辽宁基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21