评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法技术

本发明专利技术涉及评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，采用多种基因标记物对化疗药物进行敏感性评估，包括以下步骤：测定样本的基因标记物状态；根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估。本发明专利技术提供了引物组和试剂在基因标记物的甲基化情况，相对表达量的联合判别方法中的应用。通过上述方法计算的结果，可以更好的对脑胶质瘤治疗中替莫唑胺的敏感性进行评估。

A new method to evaluate the sensitivity of temozolomide in the treatment of gliomas

【技术实现步骤摘要】
评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法
本专利技术属于脑胶质瘤治疗与诊断
，特别涉及一种用于对脑胶质瘤替莫唑胺治疗效果和敏感性评估的联合基因标志物，以及检测该联合标记物的检测试剂盒和敏感性评估标准。
技术介绍
脑胶质瘤是最常见的神经系统恶性肿瘤，简单的分为四个级别。WHOI的良性肿瘤，WHOII为低度恶性，WHOIII和IV级为高度恶性。胶质瘤呈浸润性生长，恶性程度高、患者预后差。其中WHOIV胶质母细胞瘤是胶质瘤中最恶的一种，它的中位生存时间仅14.6个月。目前脑胶质瘤的标准治疗是手术(在保护功能的情况下，尽量全切)和同步放化疗和辅助化疗。替莫唑胺(TMZ)是目前最常用的烷化剂的化疗药物。TMZ是一种新型的口服二代烷化剂咪唑四嗪类衍生物(分子量为194.15)。TMZ作为前体药物，不需要经过肝脏代谢，在生理pH值条件下，经非酶催化快速转变为活性化合物5-(3-甲基三嗪-1-基)咪唑-4-酰胺(MTIC)，然后进一步分解为5-氨基-咪唑-4-酰胺(AIC)与重氮甲烷。TMZ是通过损伤肿瘤细胞的DNA，来杀死肿瘤。TMZ引起的DNA损伤主要发生在鸟嘌呤的O6和N7，以及腺嘌呤的N3位置上。因为在DNA复制过程中，错配修复系统虽能识别错误配对的碱基对，但不能为第6位氧原子甲基鸟嘌呤找到配对碱基，因此子链DNA有缺口形成，缺口随细胞分裂而逐渐积累，最终阻碍细胞复制启动，从而使细胞周期停滞在G2-M期发生细胞死亡；还可使细胞DNA的单链或双链断裂，阻断DNA的复制而抑制肿瘤生长。TMZ在恶性脑胶质瘤的治疗中已经得到了广泛的认可和应用，但肿瘤对药物的敏感性是影响化疗效果的重要因素之一。其中，DNA修复酶——O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT)在胶质瘤组织中的表达与肿瘤对TMZ的敏感性相关，其机制为，MGMT是唯一能将O6鸟嘌呤复合物从DNA上移除的蛋白，可在突变前中和这种损伤作用。MGMT主要通过不可逆地将烷化基团从O6-mG转移到MGMT蛋白145位的半胱氨酸残基上，而保护细胞免受TMZ的损伤。在这一过程中，MGMT不需要辅助因子和其它蛋白质的参与，同一蛋白即作为甲基转移酶，又作为甲基受体蛋白。同时，MGMT蛋白反应位点被烷化基团不可逆结合而失活，故该反应又称自杀反应。细胞对于DNA鸟嘌呤O6上烷化基团的修复能力取决于MGMT在细胞内的含量，而MGMT基因启动区的甲基化状态是决定MGMT表达的主要因素。因此，检测MGMT基因启动区甲基化情况，已经作为临床上评价脑胶质瘤患者对TMZ药物敏感性主要手段。然而，随着研究的不断深入，临床上发现，即使对于MGMT基因启动区甲基化程度类似的脑胶质瘤患者，其对TMZ的敏感性仍然存在一定程度的个体化差异。而其本质原因，是由于除了MGMT参与的DNA修复机制外，还存在其它DNA修复机制，能够影响TMZ的治疗效果。其中DNA碱基切除修复(baseexcisionrepair，BER)途径就是重要的通路之一。BER途径有一系列酶催化，其中N3-甲基化嘌呤糖基化酶(MPG)是该途径的启动酶，正常情况下仅在细胞核中起作用，其底物包括3-甲基腺嘌呤，7-甲基腺嘌呤，N6-乙烯基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，3-甲基鸟嘌呤，次黄嘌呤，O8-鸟嘌呤等。它负责识别并将受损的碱基从DNA链上切除，留下的脱嘌呤(AP)位点在下游其它酶的催化下，连接上正确的碱基，从而完成对DNA损伤的修复。MPG的过表达会提高BER途经的活性，使肿瘤细胞对TMZ的敏感性降低。另外，DNA修复蛋白人类AlkB同系物2(ALKBH2)也被认为可以参与TMZ细胞毒性的修复作用当中。ALKBH2是一种氧化脱甲基酶，它能够直接地去除双链或单链DNA中的N1-甲基腺嘌呤和N3-甲基胞嘧啶的损伤。ALKBH2仅存在于细胞核中，其通过与增值细胞核抗原形成复合物，主要在细胞周期的S期发挥作用，被认为在靠近复制叉的DNA修复过程中起重要作用。当ALKBH2高表达时，能够增强N1-甲基腺嘌呤和N3-甲基胞嘧啶的损伤修复，进而降低TMZ的对肿瘤细胞的毒性作用。综上，如图14所示，TMZ通过对鸟嘌呤的O6和N7以及腺嘌呤的N3位置上的甲基化修饰造成DNA损伤，目前仅仅通过检测能够修复O6位置的MGMT的甲基化程度，来评估对TMZ的敏感性是不够准确的。本专利技术从TMZ细胞毒性的三个方面，选择三个主要基因标记物，通过实验方法联合检测，能够更全面、更准确的评估TMZ的用药敏感性和治疗的有效性。
技术实现思路
针对上述技术不足，本专利技术提供了可以用于脑胶质瘤化疗过程中对替莫唑胺敏感性进行预评估的基因标记物组合，该基因标记物是由MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)基因，MPG(N3-甲基腺嘌呤转葡糖激酶)基因，ALKBH2(大肠杆菌AlkB人同系物2)基因组成，可以应用于替莫唑胺敏感性的评估；同时，本专利技术还提供了应用与评估的引物组和试剂；本专利技术还提供了上述引物组和试剂在基因标记在甲基化情况，相对表达量的联合判别方法中的应用。通过上述方法计算的结果，可以更好的对脑胶质瘤治疗中替莫唑胺的敏感性进行评估。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，采用多种基因标记物对化疗药物进行敏感性评估，包括以下步骤：测定样本的基因标记物状态；根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估。所述基因标记物包括MGMT基因，MPG基因和ALKBH2基因，以及内参基因GAPDH。所述测定样本的基因标记物状态指分别测定样本的MGMT基因启动区甲基化，MPG基因表达和ALKBH2基因表达。所述化疗药物是替莫唑胺。采用检测联合基因标记物的试剂。所述的试剂中包括：用于检测MGMT基因甲基化程度的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；用于检测MPG基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示；用于检测ALKBH2基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示；用于扩增内参GAPDH基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.7-8所示。采用包括所述试剂的试剂盒，所述试剂盒在脑胶质瘤替莫唑胺敏感性评估中的应用。所述试剂在脑胶质瘤替莫唑胺敏感性评估用试剂盒中的应用。所述根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估，具体如下：将MGMT基因启动区甲基化根据设定值分为非甲基化和甲基化；分别在非甲基化和甲基化两部分中比较MPG基因表达的参数ΔCqM是否高于阈值A，并分别得到ΔCqM高、ΔCqM低部分；在非甲基化或甲基化中的ΔCqM高、ΔCqM低部分中比较ALKBH2基因表达的参数ΔCqA是否高于阈值B，并分别得到ΔCqA高、ΔCqA低部分；依次以MGMT基因启动区、MPG基因表达、ALKBH2基因表达为从高至低的优先级；设定非甲基化和甲基化为从高至低的顺序，分别按照优先级对非甲基化和甲基化中的MPG基因表达的参数ΔCqM、ALKBH2基因表达的参数ΔCqA进行从高至低的排序并分级；该排序表示样本对替莫唑胺的敏感性从不敏感至敏感的过渡，每级表示某一敏感度。ΔCqM＝CqMPG-CqGAPDH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，采用多种基因标记物对化疗药物进行敏感性评估，包括以下步骤：测定样本的基因标记物状态；根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估。

【技术特征摘要】
2018.04.26 CN 20181038416851.评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，采用多种基因标记物对化疗药物进行敏感性评估，包括以下步骤：测定样本的基因标记物状态；根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估。2.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述基因标记物包括MGMT基因，MPG基因和ALKBH2基因，以及内参基因GAPDH。3.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述测定样本的基因标记物状态指分别测定样本的MGMT基因启动区甲基化，MPG基因表达和ALKBH2基因表达。4.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述化疗药物是替莫唑胺。5.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，采用检测联合基因标记物的试剂。6.根据权利要求5所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述的试剂中包括：用于检测MGMT基因甲基化程度的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；用于检测MPG基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示；用于检测ALKBH2基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示；用于扩增内参GAPDH基因的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.7-8所示。7.根据权利要求5所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，采用包括所述试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雷，刘一博，刘云会，刘继才，
申请(专利权)人：胤安国际辽宁基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21