一种用于选择性检测人血清白蛋白的自组装纳米荧光探针的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型酰肼希夫碱形成的自组装纳米粒子作为荧光探针使用，酰肼希夫碱在PBS缓冲液中自组装形成纳米体系，可用于人血清白蛋白（HSA）定性和定量检测。该探针优点是基于自组装和扭曲的分子内电荷转移机理，探针本身几乎没有荧光信号，与待测物作用后有明显的荧光增强现象，其合成路线简便，产率高，自组装形成纳米体系均匀快速，对待测物选择性好，灵敏度高。本发明专利技术的自组装纳米荧光探针可用于生物及临床检验样品中HSA的检测，具有良好的应用前景。

Application of self-assembled nano fluorescent probe for selective detection of human serum albumin

【技术实现步骤摘要】
一种用于选择性检测人血清白蛋白的自组装纳米荧光探针的应用
本专利技术属于荧光探针检测及应用
，更加具体地说，涉及一种酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针在检测HSA中的应用。
技术介绍
人血清白蛋白(HSA)是人体中含量最丰富的转运蛋白，在调节胶体渗透压、传递激素、转运营养物质、代谢产物和药物等多种生物学功能中发挥着重要作用。此外，它也是评估肾脏损害的常规临床生物标志物。健康人血清中HSA浓度约为35-50g/L，尿液中HSA浓度小于30mg/L。当肾脏受损时，患者尿液中的HSA水平升高。因此，HSA在临床上是一种合适的诊断慢性肾病的生物标志物，精确检测血清和尿液中HSA的水平，可以有效地早期诊断或预防慢性肾病，以及监测慢性肾病患者的生理状况。因此，HSA含量的测定具有极为重要的研究和应用意义。目前，检测HSA的方法主要有免疫分析法、液质联用蛋白组学法、电化学和BCG比色法等。然而，这些方法需要昂贵的设备和技术支撑，以及耗费的时间长，流程复杂，不利于HSA的实时快速检测。而荧光探针技术具有成本低，高灵敏度，响应时间迅速和操作流程简单等特点，克服了传统检测手段的缺点，用于HSA检测的有机分子荧光探针技术获得了很大的进展。但是，目前报道的一些HSA荧光探针分子仍有一些局限性，比如检测限高、激发波长在短波长范围、水溶性差等。因此在实际应用中未能满足样品的检测范围，或者不能有效避免样品自发荧光的干扰以及不能用于生物体内目标物的检测。面对这些局限性，设计新型的HSA荧光探针分子是非常有必要的。目前，有机分子自组装纳米粒子由于其光学稳定性、良好的生物相容性、多样性和结构设计的灵活性，在HSA的传感领域引起了广泛的关注。然而，选择性和裸眼快速检测HSA的有机分子自组装纳米探针仍然很少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，可以作为高灵敏度、高选择性的HSA荧光分析手段，和现有文献中的探针（化合物）相比较，本专利技术的自组装纳米荧光探针水溶性好，检测限低，响应速度快，生物相容性好，稳定性强，制备简单、合成成本低等优势。本专利技术作为HSA检测的应用通过下述技术方案予以实现：用于HSA检测的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，具有如下所示的结构式：所述酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针用于对HSA的定性和定量检测方面的应用。所述酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针的合成具体如下：（1）将吡嗪-2-羧酸充分溶解于无水甲醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流4-6h，待反应结束冷却后，用饱和NaHCO3调节pH值至中性，用二氯甲烷萃取并保留二氯甲烷层，旋蒸除去溶剂后得油状物吡嗪-2-羧酸甲酯；将其用无水甲醇溶解后，逐滴加入水合肼，加热回流20-22h后，冷却至室温，旋蒸除去甲醇得红色固体产物吡嗪-2-酰肼；所述（1）中吡嗪-2-羧酸甲酯与水合肼投料物质的量之比为1:（1.5-5）。（2）将4-（二乙胺基）水杨醛溶解于无水乙醇中，依次加入丙二酸二乙酯和哌啶，加热回流18-20h，冷却后旋蒸除去反应溶剂，再加入浓盐酸和冰醋酸加热回流18-22h后,转移至冰水中用NaOH调节pH至5左右，过滤水洗干燥后得灰色固体7-二乙氨基香豆素；将POCl3缓慢加入到DMF中，在20-50℃以及氩气保护下搅拌30min形成红色透明溶液，将上述灰色固体溶于DMF并加入到该红色溶液中，在60-70℃下搅拌16-20h后,转移到冰水中用NaOH调节pH为5左右，过滤后得黄色固体产物7-二乙氨基香豆素醛；所述（2）中4-（二乙胺基）水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶投料的物质的量之比为1:1.5:(1-2）。（3）将（1）和（2）所得终产物溶解于无水甲醇中,加热回流5-8h至反应完全，待反应液冷却至室温，过滤，用无水甲醇洗涤固体，真空干燥，即得到该酰肼希夫碱荧光探针分子。所述（3）中吡嗪-2-酰肼和7-二乙氨基香豆素醛的投料物质的量比为1:1。所述的合成路线如下：所述酰肼希夫碱在PBS缓冲液中形成自组装纳米荧光探针。所述PBS缓冲液的pH=7-8。所述酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，通过裸眼观察可对HSA实现快速检测，在365nm紫外灯下，溶液由无色变为绿色。所述酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，在激发波长为450nm激发下，探针本身几乎没有荧光信号，与HSA作用后，在512nm处产生很强的荧光信号，且对HSA的定量检测浓度范围为0-5mM，检测限为8.76nM。所述酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针，激发波长为450nm，发射波长约为512nm，有效的克服了水溶性差和样品自发荧光的干扰等缺点，对HSA有很好的选择性，可以用于生物体系中HSA的检测。附图说明图1为本专利技术的纳米荧光探针的核磁共振氢谱；图2为本专利技术的纳米荧光探针的核磁共振碳谱；图3为本专利技术的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针的电镜图；图4为本专利技术的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针对HSA的选择性荧光光谱图；图5为本专利技术的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针在其他干扰物存在时对HSA识别的荧光信号图；图6为本专利技术的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针的荧光强度与不同浓度的HSA响应的荧光光谱图；图7为本专利技术的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针在512nm处的荧光强度的变化值与HSA浓度的线性关系图；图8为本专利技术的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针与HSA在不同时间段的荧光强度变化图；图9为本专利技术的酰肼希夫碱自组装形成的纳米荧光探针与HSA在细胞中的荧光成像图。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所用原料及试剂均有市售。例如吡嗪-2-羧酸、水合肼、4-（二乙胺基）水杨醛、丙二酸二乙酯、哌啶等均有市售。实施例1：荧光探针的合成及其表征（1）将吡嗪-2-羧酸充分溶解于无水甲醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流5h，待反应结束冷却后，用饱和NaHCO3调节pH值至中性，用二氯甲烷萃取并保留二氯甲烷层，旋蒸除去溶剂后得油状物吡嗪-2-羧酸甲酯；将其用无水甲醇溶解后，逐滴加入水合肼，加热回流21h后，冷却至室温，旋蒸除去甲醇得红色固体产物吡嗪-2-酰肼；其中吡嗪-2-羧酸甲酯与水合肼投料物质的量之比为1:2。（2）将4-（二乙胺基）水杨醛溶解于无水乙醇中，依次加入丙二酸二乙酯和哌啶，加热回流20h，冷却后旋蒸除去反应溶剂，再加入浓盐酸和冰醋酸加热回流20h后,转移至冰水中用NaOH调节pH至5左右，过滤水洗干燥后得灰色固体7-二乙氨基香豆素；将POCl3缓慢加入到DMF中，在30℃以及氩气保护下搅拌30min形成红色透明溶液，将上述灰色固体溶于DMF并加入到该红色溶液中，在65℃下搅拌18h后,转移到冰水中用NaOH调节pH为5左右，过滤后得黄色固体产物7-二乙氨基香豆素醛；其中4-（二乙胺基）水杨醛、丙二酸二乙酯和哌啶投料的物质的量之比为1:1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针，其特征在于，具有如下所示结构式：

【技术特征摘要】
1.酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针，其特征在于，具有如下所示结构式：。2.酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针在HSA定性和定量检测中的应用。3.权利2要求所述的酰肼希夫碱形成的自组装纳米荧光探针在HSA定性和定量检测中的应用，其合成方法按如下反应制备：（1）将吡嗪-2-羧酸充分溶解于无水甲醇中，然后加入适量浓硫酸加热回流4-6h，待反应结束冷却后，用饱和NaHCO3调节pH值至中性，用二氯甲烷萃取并保留二氯甲烷层，旋蒸除去溶剂后得油状物吡嗪-2-羧酸甲酯；将其用无水甲醇溶解后，逐滴加入水合肼，加热回流20-22h后，冷却至室温，旋蒸除去甲醇得红色固体产物吡嗪-2-酰肼；其中吡嗪-2-羧酸甲酯与水合肼投料物质的量之比为1:1.5-5；（2）将4-（二乙胺基）水杨醛溶解于无水乙醇中，依次加入丙二酸二乙酯和哌啶，加热回流18-20h，冷却后旋蒸除去反应溶剂，再加入浓盐酸和冰醋酸加热回流18-22h后,转移至冰水中用NaOH调节pH至5，过滤水洗干燥后得灰色固体7-二乙氨基香豆素；将POCl3缓慢加入到DMF中，在20-50℃以及氩气保护下搅拌30min形成红色透明溶液，将上述灰色固体溶于DMF并加入到该红色溶液中，在60-70℃下搅拌16-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐靖源，王志刚，谢承志，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：天津,12