一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器及其制备和应用制造技术

一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器及其制备和应用，属于有机化学和分析化学技术领域。比率荧光传感器制备首先将化合物4－溴－1,8－萘酐和吗啉于乙二醇单甲醚中反应得到化合物1；然后将化合物1与胱二胺盐酸盐和三乙胺，反应得到化合物2；最后将化合物2和香豆素衍生物反应得到NAP－CR。本发明专利技术通过合理巧妙的设计将具有蓝光发射的香豆素荧光团和绿光发射的萘酰亚胺有机荧光团通过双硫键连接后整合于一个荧光传感器分子，当加入谷胱苷肽后，双硫键断裂使两个荧光团之间距离增大，降低了能量共振转移效率，使荧光发生比率变化，进而实现对谷胱苷肽的双通道荧光识别。

A glutathione ratio fluorescence sensor based on disulfide bond and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器及其制备和应用
本专利技术属于有机化学和分析化学
，具体涉及一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器及其制备和应用。
技术介绍
谷胱甘肽几乎存在于身体的每一个细胞，是细胞内重要的调节代谢物质，对维持人体内正常的免疫系统及生化防御体系不可或缺，能够实时快速实现谷胱甘肽的检测对疾病的监控以及早期诊断治疗具有重要意义。荧光传感器检测灵敏度高、实时快捷，已经广泛应用于生物以及临床医学等各个领域。尤其是荧光比率传感器可以应用内部两种不同发射波长的比值来检测目标，相比于单纯依赖荧光强度检测的传感器，避免了仪器、生物环境、传感器浓度以及生物体内自发荧光干扰，越来越受到研究人员的青睐(ChemicalSocietyReviews,2016.45(10):2976-3016)。其中荧光共振能量转移(FRET)机理荧光探针采用两个能量匹配的荧光团分别做为荧光供体和荧光受体，通过适宜的连接方式实现双波长荧光检测，目前在生物体内检测应用较为广泛。当荧光探针实际应用于环境、生物体系中检测被分析物时，常常面临的主要问题之一就是荧光测量结果的准确性问题，因为荧光探针在检测被分析物时，荧光强度的大小常常受到一系列因素的影响，如探针浓度、激发光强度、检测效率、光漂白、探针渗漏、细胞厚度等等。因此，在单一波长处测量荧光强度时，在实际应用中常常会产生荧光信号数据失真，从而对测量结果产生误差。为了解决这种单一波长荧光强度变化为基础的荧光测量方法所面临的荧光信号人工假象问题，通常使用荧光比率探针。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术提供一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器，该比率荧光传感器可对细胞内谷胱甘肽实现荧光检测，同时具有响应迅速，灵敏度高的特点。本专利技术解决技术问题采用以下技术方案：一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器，具有如式I所示结构：上述基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器的制备反应合成路线如下所示。上述化合物的制备方法具体为：a、化合物4－溴－1,8－萘酐和三倍摩尔量的吗啉于乙二醇单甲醚(加入的量以4－溴－1,8－萘酐为标准，1mmol：10～15ml)中加热100摄氏度反应二小时后冷却至室温，过滤得到粗产品化合物1。b、化合物1溶于乙醇(加入的量以化合物1为标准，1mmol：10～15ml)中加入五倍摩尔量的胱二胺盐酸盐，十倍量的三乙胺，80摄氏度反应六小时，冷却后浓缩，沉淀过滤，粗产品用柱层析分离方法得到黄色化合物2。c、化合物2和等摩尔量化合物3(香豆素衍生物)，等摩尔量三乙胺于二氯甲烷(加入的量以化合物2为标准，1mmol：10～15ml)中，常温下反应二小时，TLC确定反应结束后，柱层析分离目标产物NAP－CR。本专利技术同时请求保护上述基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器的应用。当谷胱甘肽加入前，化合物NAP－CR溶液的荧光只显示萘酰亚胺532nm处的荧光发射，而香豆素在463nm处的荧光几乎看不出，这是由于化合物香豆素和萘酰亚胺发生了荧光共振能量转移，香豆素荧光消失。当加入谷胱苷肽后，随着时间的增加，532nm处荧光逐渐变弱，而463nm处属于香豆素的荧光逐渐增强，说明萘酰亚胺和香豆素两个荧光团之间的能量转移逐渐变弱。即加入谷胱苷肽后，比率荧光传感器NAP－CR中的双硫键发生了断裂，使香豆素和萘酰亚胺之间的距离发生了明显的变化，通过合理调控距离进而控制两个荧光团之间荧光共振能量转移，使其在识别谷胱苷肽前后荧光发生明显的比率变化。有益效果：本专利技术以双硫键作为谷胱苷肽识别位点，基于荧光共振转移机理设计了以萘酰亚胺和香豆素荧光团为供受体系的比率荧光分子探针。其中萘酰亚胺和香豆素荧光团能量匹配，光物理性质优良，以其作为荧光供受体的荧光共振能量转移荧光探针来识别谷胱苷肽将对生物体内谷胱苷肽的识别提供更多有价值的信息。本专利技术通过合理巧妙的设计将具有蓝光发射的香豆素荧光团和绿光发射的萘酰亚胺有机荧光团通过双硫键连接后整合于一个荧光传感器分子，当加入谷胱苷肽后，双硫键断裂使两个荧光团之间距离增大，降低了能量共振转移效率，使荧光发生比率变化，进而实现对谷胱苷肽的双通道荧光识别。附图说明图1为化合物2的氢谱图；图2为化合物2的碳谱图；图3为化合物NAP－CR的氢谱图；图4为化合物NAP－CR的碳谱图；图5为化合物NAP－CR的紫外吸收光谱；图6为化合物NAP－CR的荧光光谱变化图；图7为化合物NAP－CR的荧光强度463nm和532nm比率随时间的变化曲线。具体实施方式下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。实施例1化合物的合成(a)化合物1的合成取吗啉(4.74g，54.3mmoL)慢慢滴入到放有4-溴-1，8-萘酐(5g，18.1mmoL)的30毫升乙二醇单甲醚中，于100摄氏度反应加热两小时，TLC追踪点板发现原料反应完全，冷却静置，析出黄色针状晶体，过滤，得粗产品3.48g，收率68％。粗产品未经处理直接进行下一步反应。(b)化合物2的合成取化合物1(1g，3.53mmol)和五倍摩尔量的胱二胺盐酸盐放于50毫升乙醇中加热回流80摄氏度，再放入十倍摩尔量的三乙胺，反应约六个小时后，TLC追踪点板发现原料反应完全，减压旋干，柱层析分离，馏出液为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(V二氯甲烷：V甲醇＝20：1)，Rf值0.4，产品884mg，收率60％。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)8.6(s,2H,-NH2),8.46-8.52(m,2H,-ArH),8.35(t,1H,J＝6.8Hz,-ArH),7.65(1H,-ArH),7.18(1H,-ArH),4.41(2H,-CH2CH2-),4.01(m,4H,-CH2CH3),3.47(m,2H,-CH2CH2-),2.24-3.29(m,6H),3.00(2H,-CH2CH2-).13CNMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)164.32,163.86,155.94,133.04,131.53,130,45,129.77,125.90,125.88,122.71,116.35,115.04,66.94,53.40,39.34,38.99,35.49,35.33.(c)化合物NAP－CR的合成取100mg的化合物2溶于10毫升二氯甲烷中再加入等摩尔量的三乙胺，常温搅拌，慢慢滴入等摩尔量的化合物3(香豆素衍生物，Tetrahedron.2010；66:9762-9768.)的二氯甲烷(10毫升)溶液，常温搅拌，TLC点板确定反应完全，将反应液减压旋干，柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝100：1)得到最终产物NAP－CR的质量为89.6mg，产率为56.6％。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)9.10(宽峰,1H,-NH),8.70(s,1H,-ArH),8.60(d,1H,J＝7.0Hz,-ArH),8.55(d,1H,J＝8.0Hz,-ArH),8.44(d,1H,J＝8.5Hz,-ArH),7.72(d,1H,J＝7.8Hz,-ArH),7.44(d,1H,J＝8.5Hz,-ArH),7.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器的制备方法，其特征在于，该比率荧光传感器的合成路线如下：具体制备步骤为：S1.化合物4－溴－1,8－萘酐和吗啉于乙二醇单甲醚中加热反应二小时后冷却至室温，过滤得到粗产品化合物1；S2.化合物1溶于乙醇中加入胱二胺盐酸盐和三乙胺，加热反应六小时，冷却后浓缩，沉淀过滤，粗产品用柱层析分离方法得到黄色化合物2；S3.化合物2和等摩尔量香豆素衍生物等摩尔量三乙胺于二氯甲烷中，常温反应二小时，TLC确定反应结束后，柱层析分离目标产物NAP－CR

【技术特征摘要】
1.一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器的制备方法，其特征在于，该比率荧光传感器的合成路线如下：具体制备步骤为：S1.化合物4－溴－1,8－萘酐和吗啉于乙二醇单甲醚中加热反应二小时后冷却至室温，过滤得到粗产品化合物1；S2.化合物1溶于乙醇中加入胱二胺盐酸盐和三乙胺，加热反应六小时，冷却后浓缩，沉淀过滤，粗产品用柱层析分离方法得到黄色化合物2；S3.化合物2和等摩尔量香豆素衍生物等摩尔量三乙胺于二氯甲烷中，常温反应二小时，TLC确定反应结束后，柱层析分离目标产物NAP－CR2.根据权利要求1所述的一种基于双硫键的谷胱苷肽比率荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1中加入吗啉的摩尔量为4－溴－1,8－萘酐摩尔量的三倍；加入乙二醇单甲醚的量以4－溴－1,8－萘酐为标准，按照4－溴－1,8－萘酐：乙二醇单甲醚＝1mmol：10～15ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓琳，宫蕾，李树亮，李建军，姜凯铧，詹世平，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21