一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，核心检测组件为将时间分辨荧光微球与透明质酸(HA)抗体偶联制成的荧光探针和包被在检测卡NC膜上的HA‑BSA偶联物，检测时，NC膜检测区的荧光强度与样本中的HA含量成负相关，可准确定量的检测HA的含量。本发明专利技术具有操作简便和测量准确的优点，有利于快速准确的进行肝纤维化的早期诊察。

【技术实现步骤摘要】
一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒
本专利技术属于体外诊断用试剂盒
，尤其是涉及一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒。
技术介绍
时间分辨荧光分析法(TRFIA)实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。时间分辨荧光具有衰变时间长和Stokes位移大的优点，可在没有激发光照射时仍发出荧光效应(1～2ms)，且因Stokes位移较大，可容易的区分激发光和发射光，最大程度的避免激发光源杂散光的干扰。在提高检测灵敏度上有明显的优势。时间分辨荧光与免疫层析技术的结合使用，在提高检测灵敏度和快速、准确定量上有明显的优势。应用于时间分辨的原料主要为镧系稀土元素，其中最常用的为铕(Eu)，因其在水溶液中不稳定，在时间分辨免疫分析中常需要增强剂的辅助。而随着包埋技术和核壳结构的发展，铕包裹于可稳定在水中的微球里，提高了其在水体系中的稳定性。并且微球的表面常修饰有活性基团，如羧基、氨基或其它支链或直链基团，便于与生物活性物质的偶联。据报道中国属于肝病的高发国家，肝病患者一旦合并肝纤维化时，病死率将会提高，最终发展为肝硬化、肝衰竭、肝癌，危害性极大。故早期诊断并积极开展对症治疗对于维护患者生命安全，促进其康复具有重要意义。肝纤维化是指各种类型的急慢性肝损伤病理转归，容易对正常肝组织的功能与结构造成损伤，具有可逆性；及时在肝硬化早期进行逆转，对于阻断肝硬化，保护肝功能意义重大，肝纤维化属于肝脏疾病向肝硬化发展的必经阶段，主要表现为肝细胞内出现细胞外基质的过度沉积，HA、LN、PCⅢ、CⅣ均为其主要成分，能够在一定程度上呈现肝纤维化进程。HA属于高分子多糖，在肝脏受损时合成加快，同时由于肝脏降解能力的下降，易出现异常升高，能够较好地反映肝细胞损伤及肝纤维化活动情况属于预测肝组织纤维化的敏感指标。当肝脏出现纤维化时，肝窦内皮细胞膜即会出现改变，造成HA吸收受阻，进而导致其水平升高。快速准确的检测血液标本中的HA含量，有利于早期评估肝纤维化的进程，并且是无创检测，避免肝活检时给患者带来的其它风险。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，以实现快速无创定量检测肝纤维化指标HA含量。具有灵敏度高，检测便捷、快速的优点。一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其中检测卡包括吸水纸、NC膜、结合垫、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴于PVC胶板的检测条和带有读数视窗的卡壳组成，反应部件包括荧光探针和包被在NC膜上的检测区和质控区；其中荧光探针为时间分辨荧光微球偶联HA抗体。优选的，所述荧光探针的制备包括如下步骤，1)取0.01～0.05MpH为5.0-7.0的MES缓冲液置于离心管中；2)向上述离心管中加入羧基修饰的时间分辨荧光微球，加入的荧光微球与缓冲液的体积比为1：5-1：20；3)超声30s-1min进行重悬；4)将上述分散均一的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物；5)吸取0.01～0.05MpH为5.0-7.0的MES缓冲液加入到上述沉淀中，超声30s-1min进行重悬；6)向分散均一的体系中加入10-20mg/mL的EDC和10-20mg/mL的NHS，室温混匀15-20min后，8000-12000g离心10-15min，弃上清，沉淀物用上述MES缓冲液复溶，置于2-8℃储存备用；7)将一定量的HA抗体加入到步骤6)中所述的体系中进行偶联，使其终浓度为60-500μg/mL，室温旋转混匀2-4h；8)向步骤7)中所述的偶联体系中加入质量体积比为8-10％的BSA，使其BSA的终浓度为1-2％，终止偶联，此过程需室温旋转混匀0.5-2h；9)将步骤8)中所述的已终止偶联的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物；10)用含蔗糖质量浓度为5-8％，海藻糖质量浓度为3-5％以及体积浓度为0.03-0.3％的Procline300的pH为5.0-7.0的0.01MMES缓冲液，将沉淀物重悬，得到用于检测HA的荧光探针浓储液；检测HA的荧光探针浓储液中HA的抗体浓度为60-500μg/mL。优选的，检测区包被有HA-BSA偶联物；质控区包被有亲和素或链霉亲和素(SA)。包被有SA和HA-BSA的NC膜，通过将包被液喷涂在NC膜的质控区和检测区获得；所述的包被液是将SA和HA-BSA分别用含有质量浓度为0.5％-2％蔗糖、质量浓度0.1％-1％海藻糖、体积浓度0.03％-0.3％procline3000.01M的PBS(pH7.0-8.0)的缓冲液配制成终浓度0.5-2.5mg/mL的溶液，优选的配制成终浓度0.6-1mg/mL的溶液；含SA的包被液喷涂在质控区、含HA-BSA的包被液喷涂在检测区，喷涂量控制在0.5-1.5μL/cm，优选的0.75-1μL/cm。优选的，时间分辨荧光微球内部包裹有镧系稀土元素；优选的，Eu(铕)和Tb(铽)；且时间分辨荧光微球的粒径为100-300nm，优选的，200nm。优选的，所述检测区包被的HA-BSA偶联物，其制备包括如下步骤，1)用0.01-0.05MpH为7.0-8.0的PBS缓冲液，将碳二亚胺(EDC)配制成终浓度为10-20mg/mL的EDC溶液；2)称取一定量HA，将其置于0.1-0.6M的NaOH溶液中，配制成终浓度为5-10mg/mL的HA溶液；3)用0.01-0.05MpH为7.0-8.0的PBS缓冲液，将BSA配制成终浓度为8-10mg/mL的BSA溶液；4)将步骤1)中所述的EDC溶液与步骤2)中所述的HA溶液按体积比为1：1-1：5进行室温避光混合15-20min；5)将步骤3)中所述的BSA溶液与步骤4)中所述的混合液按体积比为1：1-1：5混匀，室温避光混匀2-4h；6)将上述偶联后的混合液进行透析，透析时间为18-24h，即可得到HA-BSA的偶联物。优选的，所述的质控区和检测区的制备包括如下步骤，1)用含有质量浓度为0.5％-2％蔗糖、质量浓度0.1％-1％海藻糖、体积浓度0.03％-0.3％procline3000.01M的PBS(pH7.0-8.0)的缓冲液将SA配制成终浓度为0.5-2.5mg/mL的溶液；HA-BSA配制成终浓度0.5-2.5mg/mL的溶液；优选的，用0.01M含质量分数为0.5-0.8％蔗糖和0.2-0.5％海藻糖、0.03-0.1％procline300的PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH为pH7.0-8.0，将SA和HA-BSA分别配制成终浓度为0.6-1.5mg/mL和0.6-1.5mg/mL的包被液；2)通过喷金划线机将配制好的包被液分别喷涂在NC膜对应质控区和检测区的位置，喷涂量控制在0.5-1.5μL/cm，优选的0.75-1μL/cm。优选的，所述荧光探针以稀释液或喷涂于结合垫的形式存在；当保存于样本稀释液中时，样本稀释液为0.01-0.05M且pH为7.0-8.0的PBS缓冲液，其中应至少包含质量浓度为0.5-0.8％的BSA、质量浓度为0.3-0.8％的蔗糖、质量浓度为0.2-0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其中检测卡包括吸水纸、NC膜、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴于PVC胶板的检测条和带有读数视窗的卡壳组成，其特征在于：反应部件包括荧光探针和包被在NC膜上的检测区和质控区；其中荧光探针为时间分辨荧光微球偶联HA抗体。

【技术特征摘要】
1.一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其中检测卡包括吸水纸、NC膜、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴于PVC胶板的检测条和带有读数视窗的卡壳组成，其特征在于：反应部件包括荧光探针和包被在NC膜上的检测区和质控区；其中荧光探针为时间分辨荧光微球偶联HA抗体。2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：所述荧光探针的制备包括如下步骤，1)取0.01～0.05MpH为5.0-7.0的MES缓冲液置于离心管中；2)向上述离心管中加入羧基修饰的时间分辨荧光微球，加入的荧光微球与缓冲液的体积比为1：5-1：20；3)超声30s-1min进行重悬；4)将上述分散均一的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物；5)吸取0.01～0.05MpH为5.0-7.0的MES缓冲液加入到上述沉淀中，超声30s-1min进行重悬；6)向分散均一的体系中加入10-20mg/mL的EDC和10-20mg/mL的NHS，室温混匀15-20min后，8000-12000g离心10-15min，弃上清，沉淀物用上述MES缓冲液复溶，置于2-8℃储存备用；7)将一定量的HA抗体加入到步骤6)中所述的体系中进行偶联，使其终浓度为60-500μg/mL，室温旋转混匀2-4h；8)向步骤7)中所述的偶联体系中加入质量体积比为8-10％的BSA，使其BSA的终浓度为1-2％，终止偶联，此过程需室温旋转混匀0.5-2h；9)将步骤8)中所述的已终止偶联的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物；10)用含蔗糖质量浓度为5-8％，海藻糖质量浓度为3-5％以及体积浓度为0.03-0.3％的Procline300的pH为5.0-7.0的0.01MMES缓冲液，将沉淀物重悬，得到用于检测HA的荧光探针浓储液；检测HA的荧光探针浓储液中HA的抗体浓度为60-500μg/mL。3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：检测区包被有HA-BSA偶联物；质控区包被有亲和素或链霉亲和素(SA)；包被有SA和HA-BSA的NC膜，通过将包被液喷涂在NC膜的质控区和检测区获得；所述的包被液是将SA和HA-BSA分别用含有质量浓度为0.5％-2％蔗糖、质量浓度0.1％-1％海藻糖、体积浓度0.03％-0.3％procline3000.01M的PBS(pH7.0-8.0)的缓冲液配制成终浓度0.5-2.5mg/mL的溶液，优选的配制成终浓度0.6-1mg/mL的溶液；含SA的包被液喷涂在质控区、含HA-BSA的包被液喷涂在检测区，喷涂量控制在0.5-1.5μL/cm，优选的0.75-1μL/cm。4.根据权利要求1或2所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：时间分辨荧光微球内部包裹有镧系稀土元素；优选的，Eu(铕)和Tb(铽)；且时间分辨荧光微球的粒径为100-300nm，优选的，200nm。5.根据权利要求1或3所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：所述检测区包被的HA-BSA偶联物，其制备包括如下步骤，1)用0.01-0.05MpH为7.0-8.0的PBS缓冲液，将碳二亚胺(EDC)配制成终浓度为10-20mg/mL的EDC溶液；2)称取一定量HA，将其置于0.1-0.6M的NaOH溶液中，配制成终浓度为5-10mg/mL的HA溶液；3)用0.01-0.05MpH为7.0-8.0的PBS缓冲液，将BSA配制成终浓度为8-10mg/mL的BSA溶液；4)将步骤1)中所述的EDC溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘萍，栾大伟，刘朝阳，
申请(专利权)人：博奥赛斯天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12