用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置及评价方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及微生态制剂药物的活性评价领域，具体而言，涉及一种用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置及活性评价方法。所述微生物群落共培养装置包括纯培养管和共培养盘，所述纯培养管通过连接除氧器实现厌氧培养；所述共培养盘通过连接管和纯培养管连接；所述共培养盘的上壁有培养基采样口和培养基回注口，所述培养基采样口和培养基回注口的上部有小透气胶塞；所述连接管上有连通阀。本发明专利技术设计的共培养系统，实现了需氧菌、厌氧菌和兼性菌在同一培养体系中培养，即保持相对独立，又相互连通。在缓和的振荡培养条件下，各培养腔室之间的培养液缓慢交流，相互作用，最大程度上模拟了微生物在肠道中的生存状态。

Microbial Community Co-culture Device and Evaluation Method for in vitro Activity Evaluation of Microecological Agents

【技术实现步骤摘要】
用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置及评价方法
本专利技术涉及微生态制剂药物的活性评价领域，具体而言，涉及一种用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置及活性评价方法。
技术介绍
微生态活菌制品由人体正常或无害外籍微生物加工制成，用于治疗菌群失调类疾病。其作用途径主要通过抑制有害菌生长，促进益生菌生长，来实现体内环境再平衡。临床应用广泛。我国已批准上市的微生态制剂有22种，涉及13种微生物，年销售额数十亿。微生态制剂可能的作用机制包括：细菌素、多肽、蛋白、生境改变、竞争性抑制等等，作用机理复杂，且活性成分随着微生物群落的生长而呈现动态变化。因此，不同于有效成分明确的化学药，评价微生态活菌制剂的药物活性非常困难。有文献报道采用动物试验的方法，通过长期口服给药后检测受试动物体内的微生物群落的变化，并与对照组比较，评价药物的活性。该方法受到个体差异、试验时长、样本量、判定标准、经济性等因素影响，无法作为一种标准的检测方法应用于药物的质量标准中。相比而言，体外活性评价方法操作简便、结果明确。它以特定的某种或几种微生物为研究对象，消除了试验动物个体差异、样本量大小带来的不确定因素。通过动态监测培养体系中微生物群落的变化情况，与空白对照组比较，结合统计学分析，综合评价药物活性。该方法结果客观、明确。由于缺乏专业的培养体系及培养装置，目前，文献收载的微生态制剂的体外活性评价方法，多以单一微生物为研究对象，如对金黄色葡萄球菌的抑制作用或对乳酸杆菌的促生长作用等等，没有充分考虑肠道微生物之间的相互作用，评价结果有较大的局限性。随着微生态制剂制药产业的不断发展，质量控制标准也要相应提高，建立微生态制剂的体外活性评价方法，对微生态制剂产业健康发展意义重大。
技术实现思路
本专利技术公开了一套用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置。将多种试验微生物接种至共培养装置中培养，检测药物作用下，微生物群落的变化情况，评价药物对共培养微生物的作用。一种用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置，包括纯培养管和共培养盘，所述纯培养管通过连接管和共培养盘连接，主要材质为玻璃，少量金属、橡胶、pvc等；所述共培养盘的上壁有培养基采样口和培养基回注口，所述培养基采样口和培养基回注口的上部有小透气胶塞；所述连接管上有连通阀，连通阀可关闭纯培养管和共培养盘之间的通路，关闭后纯培养管可以从连接管上取下。培养基采样口和培养基回注口直径为5mm，采用小透气胶塞密封，有效调节共培养盘中的压力，同时，由于培养基采样口和培养基回注口管道较细长，有效避免了外界空气过度进入影响共培养盘中的氧含量。所述共培养盘周围的连接管均匀分布；连接管的数量为4-14个；所述纯培养管的直径为4cm，高度为11cm，在高度为7-9cm处设置刻度线；共培养盘的直径为10cm，高度为2.5cm；连接管直径5mm，长度3cm。所述共培养系统，纯培养管和共培养盘不限于上述体积，可按比例扩大或缩小。连接管为细长设计，既可以保证培养基或微生物在两个培养容器中有效交换，又可以限制交换量，保持纯培养管中稳定的需氧或厌氧条件。所述纯培养管的上部有胶塞；所述胶塞为透气或半透气。所述纯培养管连接除氧器，所述除氧器由除氧剂室通过滤膜和纯培养管盖组成，纯培养盖上还有减压囊，在培养过程中微生物代谢产生的气体，可排放入减压囊，保证纯培养管内压力稳定。所述除氧剂室和纯培养管盖材质为pvc，除氧剂室和纯培养管盖连接处有pp材质的过滤膜，防止除氧剂颗粒进入纯培养盖同时保持除氧室和纯培养管良好的通透性。具体操作时，只需将纯培养管盖扣在需要进行厌氧培养的纯培养管上，密封橡胶圈可将两者紧密贴合，实现厌氧培养环境。所述纯培养管盖和纯培养管采用密封橡胶圈连接。一种微生物菌落共培养的评价方法，采用以下步骤：一种微生物菌落共培养的评价方法，其特征在于，采用以下步骤：(1)将上述共培养系统置于生物安全柜内，从任意纯培养管加液体培养基，设定样品组和对照组，待培养基在培养盘和纯培养管分配均匀，纯培养管中培养基达到刻度线，关闭连通阀；其中样品组为含有药物的培养基，对照组为不加药物的培养基；(2)在纯培养管中接种相应的试验微生物，将共培养装置移入培养箱中，先预培养0.5-1小时，然后打开连通阀，10～20r/min振荡培养；(3)对培养物中各试验微生物进行计数，计算样品组中各微生物的lg增加值或减少值；(4)采用χ2检验的方法检验对照组和样品组益生菌和有害菌构成比，评价药物对微生物菌群的作用效果。进一步地，步骤(1)所述的药物包括：乳酸菌素、活菌制剂、中成药和化学药物等，具有改善肠道菌群作用的药物；也可以是微生物代谢产物提取物，用本专利技术验证其活性。进一步地，步骤(4)所述的检验方法的具体步骤为：(1)培养结束后，计数分析对照组和样品组培养物中各微生物的含量；(2)与对照组比较，计算样品组每1ml培养物中，各微生物的对数增加值或减少值；(3)对每10ml中，样品组和对照组中有害菌、益生菌的构成比进行χ2检验。(4)根据结果判定标准进行结果判断；其中结果判定标准为：所述培养基采样口用于在培养过程中对共培养盘中的培养物进行取样，取样量为1～5ml，取样同时，自培养基回注口加入取样量同体积的无菌培养基。步骤(2)所述的接种完成后，需要厌氧条件的微生物，用透气胶塞封口纯培养管口，然后将除氧器连接纯培养管，形成厌氧条件；需要微需氧条件的微生物，用半透气胶塞封口纯培养管口，形成微需氧条件；需要有氧条件的微生物，用透气胶塞封口纯培养管口。需要厌氧条件的微生物在培养的时候除氧剂室中有厌氧指示剂。如培养过程中厌氧指示剂变色，则需更换除氧器。试验完成后，可通过除氧器底端的除氧剂室底盖，更换失效的除氧剂，除氧器可重复使用。进一步地，所述的液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆木瓜蛋白水解物3g，牛肉膏粉3g，酵母膏粉10g，葡萄糖10g，乳糖5g，麦芽糖1.5g，纤维二糖1.5g，可溶性淀粉1g，甘露醇0.5g，半胱氨酸-盐酸0.25g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，碳酸氢钠6g，氯化钙0.15g，硫酸镁0.1g，醋酸钠0.15g，柠檬酸铵0.1g，硫酸亚铁0.02g，硫酸锰0.02g，硫酸锌0.02g，硫酸铜0.01g，维生素K10.5ml，氯化钠2g，叶酸1mg，烟酸1mg，生物素2mg，加入500ml牛肠浸提液，蒸馏水500ml。所述牛肠浸提液的制备方法为：取牛小肠250g，牛结肠250g，无菌水冲洗数次，粉碎机粉碎，加入1000ml蒸馏水，搅拌均匀，置4℃存放48小时，六层医用纱布过滤，取滤液即得。步骤(2)根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，步骤(2)所述的试验微生物须同时包含益生菌、中性菌和有害菌；其中所述益生菌为长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、布氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌中的一种或几种；所述中性菌为丁酸梭菌、粪肠球菌、粪链球菌、普通拟杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、艰难梭菌和粘液真杆菌中的一种或几种；所述有害菌为乙型副伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和福氏志贺氏菌中的一种或几种；所述益生菌、中性菌和有害菌也可使用其他模式菌株或分离自人或动物肠道的非模式菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置，其特征在于，包括纯培养管（1）和共培养盘（2），所述纯培养管（1）通过连接管（3）和共培养盘（2）连接；所述共培养盘（2）的上壁有培养基采样口（5）和培养基回注口（6），所述培养基采样口（5）和培养基回注口（6）的上部有小透气胶塞（7）；所述连接管（3）上有连通阀（4）。

【技术特征摘要】
1.用于微生态制剂体外活性评价的微生物群落共培养装置，其特征在于，包括纯培养管（1）和共培养盘（2），所述纯培养管（1）通过连接管（3）和共培养盘（2）连接；所述共培养盘（2）的上壁有培养基采样口（5）和培养基回注口（6），所述培养基采样口（5）和培养基回注口（6）的上部有小透气胶塞（7）；所述连接管（3）上有连通阀（4）。2.根据权利要求1所述的共培养装置，其特征在于，所述共培养盘（2）周围的连接管（3）均匀分布，连接管的数量为4-14个；所述纯培养管（1）的直径为4cm，高度为11cm，在高度为7-9cm处设置刻度线（17）；共培养盘（2）的直径为10cm，高度为2.5cm；连接管（3）直径5mm，长度3cm；所述培养基采样口（5）和培养基回注口（6）直径为5mm。3.根据权利要求1或2所述的共培养装置，其特征在于，所述纯培养管（1）的上部有胶塞（8）；所述胶塞（8）为透气或半透气。4.根据权利要求1或2所述的共培养装置，其特征在于，所述纯培养管（1）连接除氧器（9），所述除氧器（9）由除氧剂室（10）通过滤膜（11）和纯培养管盖（12）组成，纯培养盖（12）上还有减压囊（13）。5.根据权利要求4所述的共培养装置，其特征在于，所述除氧剂室（10）和纯培养管盖（12）材质为pvc，除氧剂室（10）和纯培养管盖（12）连接处有pp材质的过滤膜（11）。6.根据权利要求4所述的共培养装置，其特征在于，所述纯培养管盖（12）和纯培养管（1）采用密封橡胶圈（16）连接。7.一种微生物菌落共培养的评价方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）将权利要求2-6任一项所述的共培养系统置于生物安全柜内，从任意纯培养管（1）加液体培养基，平行设定样品组和对照组，其中样品组为含有药物的培养基，并混合均匀；对照组为不加药物的培养基；待培养基在培养盘（2）和纯培养管（1）分配均匀，纯培养管（1）中培养基达到刻度线（17），关闭连通阀（4）；（2）在纯培养管（1）中接种相应的试验微生物，将共培养装置移入培养箱中，先预培养0.5-1小时后，打开连通阀，继续缓和振荡培养；（3）对培养物中各试验微生物进行计数，计算样品组中各微生物的lg增加值或减少值；（4）采用χ2检验的方法检验对照组和样品组益生菌和有害菌构成比，评价药物对微生物菌群的作用效果。8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，步骤（4）所述的检验方法的具体步骤为：（1）培养结束后，计数分析对照组和样品组培养物...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁勃，刘新泳，李军，胡德福，国明，沈振，徐晓洁，
申请(专利权)人：山东大学，山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37