新型抗体分子、其制备方法及其用途技术

本发明专利技术提供了一种新型的经人工设计的抗体分子，其包含(i)单结构域抗原结合位点；(ii)结合抗原的Fab片段；其中所述(i)位于所述(ii)的轻链可变结构域(VL)的N端或轻链恒定区(CL)的C端，或者所述(i)位于所述(ii)的重链可变结构域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1结构域的C端，且所述(i)和(ii)分别结合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之间具有或者不具有连接肽。和位于所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc结构域。本发明专利技术还提供了编码所述抗体分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、包含所述抗体分子的免疫缀合物和药物组合物、以及所述抗体分子在疾病的免疫治疗、预防和/或诊断上的用途。

New antibody molecule, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
新型抗体分子、其制备方法及其用途专利
本专利技术总体上涉及免疫学和抗体工程领域。具体而言，本专利技术涉及多种新型的经人工设计的抗体分子、编码所述抗体分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、包含所述抗体分子的免疫缀合物和药物组合物、以及所述抗体分子在疾病的免疫治疗、预防和/或诊断上的用途。专利技术背景抗体分子能够与其相应的抗原发生靶向性的特异性结合，正日益成为针对各种疾病(例如，癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。但是，仅针对一种靶点的单特异性抗体在临床应用上存在一些局限性。患者在接受单特异性抗体治疗后可能产生耐药性或无应答。随着对癌症和其他多种疾病的研究，认识到了往往有多种信号转导通路参与疾病的发生和发展，单一靶点的免疫疗法在许多疾病中通常并不足以发挥对疾病的治疗作用。由于多特异性抗体(例如，双特异性抗体)能够特异性结合不同抗原，当一种抗原位于特定的免疫细胞上，另一种抗原位于疾病细胞上时，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)可以将特定的免疫细胞重新定向至疾病细胞，以增强免疫细胞对疾病细胞的杀伤力。另外，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)也能够设计为同时作用于两种或多种不同介质的信号转导通路。这些优势特性为多特异性抗体(例如，双特异性抗体)开辟了广阔的应用前景。已经通过抗体工程开发了大量富于想象力的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)样式并且研究了它们在疾病应用上的适用性(BrinkmannU.和KontermannR.E.,Themakingofbispecificantibodies，Mabs,2017,9(2):182-212)。目前，批准上市的2个双特异性抗体产品分别是Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab以及TrionPharma公司开发的Catumaxomab。Blinatumomab是第1个在美国获批上市的用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和B前体急性淋巴细胞白血病(ALL)的一种分子量约55KDa的单链双特异性抗体，由分别针对CD19分子和针对CD3分子的两种单链Fv分子通过柔性连接肽融合而成，其利用几乎在所有的B淋巴细胞肿瘤中都表达的CD19和在T细胞上表达的CD3，使T细胞与靶向细胞(肿瘤细胞)紧密联结在一起，T细胞释放穿孔素和粒端酶进入突触间隙，引起肿瘤细胞发生一系列化学反应，从而消灭肿瘤细胞(NagorsenD.和BaeuerleP.A.,ImmunomodulatorytherapyofcancerwithTcell-engagingBiTEantibodyblinatumomab，ExpCellRes，2011，317：1255-1260)。Catumaxomab是由两个分别源自亲本小鼠IgG2a同种型和大鼠IgG2b同种型的半抗体组成的嵌合体，其中每个半抗体具有一条轻链和一条重链，抗CD3大鼠IgG2b半抗体用于T细胞识别，抗肿瘤细胞表面抗原EpCAM(上皮细胞黏附分子)的小鼠IgG2a半抗体用于肿瘤细胞识别(CheliusD等人，Structuralandfunctionalcharacterizationofthetrifunctionalantibodycatumaxomab，MAbs，2010，2:309-319)。Catumaxomab于2009年4月在欧洲获准用于治疗由EpCAM阳性上皮源性转移瘤所引起的恶性腹水。多特异性抗体(例如，双特异性抗体)根据不同的组成部分以及构建方式，可以分为许多种类。例如，根据多特异性抗体结构的左右基本上对称性，可分为对称结构和不对称结构；根据多特异性抗体有无IgG的Fc区，可分为有Fc区的抗体样式和无Fc区的抗体样式；根据多特异性抗体中抗原结合位点的数量可分为二价、三价、四价或更多价的抗体等。现有技术中的多特异性抗体样式在制备和应用中各有利弊，例如，虽然Blinatumomab可以通过重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行大规模培养生产，但是容易形成聚集物、在体内半衰期很短，实际使用的时候需要额外配备连续输液装置；Catumaxomab生产工艺复杂且鼠异源抗体比较容易在人体产生免疫原性问题。因此，本领域仍然需要可供选择的具有改善性能的多特异性抗体样式。本专利技术提供了一种新的多特异性抗体样式，所述抗体样式通过使用分子量较小且稳定性高的单结构域抗原结合位点作为一种构建模块，与Fab片段的N端或C端连接，将所得的连接物再连接Fc区后，易于在体外的培养细胞中有效表达，不需要复杂的生产工艺；另外，在本专利技术抗体样式中Fc区的存在使得在培养细胞中表达本专利技术的抗体后，使用单步亲和层析即可获得经纯化的抗体，并且本专利技术的抗体在体内具有较长的血清半寿期并能引发效应子功能，诸如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。本专利技术的多特异性抗体样式能够保持该多特异性抗体中的各抗原结合位点与相应的不同表位结合的亲和力，且在结合不同表位的时候互相之间不会产生空间位阻的干扰，具有好的成药性。进一步地，本专利技术的多特异性抗体样式是物理稳定的和生物学稳定的，这允许该抗体具有更好的生产性和可发展性。专利技术概述本文公开了通过抗体工程方法构建的一种新型的抗体分子。所述抗体分子能够以高亲和力和高特异性与一种或多种抗原结合，优选地，与两种以上的抗原结合。本专利技术还提供了编码所述抗体分子的核酸分子、用于产生所述抗体分子的表达载体、宿主细胞和方法。本专利技术还提供了包含本专利技术抗体分子的免疫缀合物和药物组合物。本文公开的抗体分子可以单独或与其他药物或其他治疗模式联合用来治疗、预防和/或诊断疾病，如自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性传染病或败血症)、肿瘤等。因此，在一个方面，本专利技术提供了具有以下一个或多个特性的抗体分子：(a)以高亲和力，例如以至少约107M-1、优选地约108M-1和更优选地约109M-1或更强的亲和力常数与一种或多种抗原特异性结合；(b)易于在体外的培养细胞中表达，且抗体分子的各条链之间能够正确偶合或配对；(c)具有良好的物理稳定性，特别地，具有良好的长期热稳定性；且能长时间保持生物学活性；和(d)在与一种或多种抗原特异性结合后，通过调节(例如，抑制或者激活)各抗原所参与的信号传导通路来发挥生物学功能；(e)在与一种或多种抗原特异性结合后，通过Fc区发挥效应子功能。在一个实施方案中，本专利技术的抗体分子包含(i)单结构域抗原结合位点；(ii)结合抗原的Fab片段；其中所述(i)位于所述(ii)的轻链可变结构域(VL)的N端或轻链恒定区(CL)的C端，或者所述(i)位于所述(ii)的重链可变结构域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1结构域的C端，且所述(i)和(ii)分别结合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之间具有或者不具有连接肽；以及位于所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc结构域。在一个实施方案中，本专利技术的抗体分子包含至少四个抗原结合位点，分别是至少两个单结构域抗原结合位点和至少两个Fab片段中的抗原结合位点，结合至少四种、三种、两种不同抗原，或者结合一种相同抗原。对于所结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体分子，其包含(i)单结构域抗原结合位点；(ii)结合抗原的Fab片段；其中所述(i)位于所述(ii)的轻链可变结构域(VL)的N端或轻链恒定区(CL)的C端，或者所述(i)位于所述(ii)的重链可变结构域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1结构域的C端，且所述(i)和(ii)分别结合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之间具有或者不具有连接肽；以及位于所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc结构域。

【技术特征摘要】
2018.03.27 CN 20181025910231.一种抗体分子，其包含(i)单结构域抗原结合位点；(ii)结合抗原的Fab片段；其中所述(i)位于所述(ii)的轻链可变结构域(VL)的N端或轻链恒定区(CL)的C端，或者所述(i)位于所述(ii)的重链可变结构域(VH)的N端或免疫球蛋白CH1结构域的C端，且所述(i)和(ii)分别结合相同或者不同的抗原，所述(i)和(ii)之间具有或者不具有连接肽；以及位于所述(i)和(ii)的C端的(iii)免疫球蛋白Fc结构域。2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述单结构域抗原结合位点选自重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、天然缺乏轻链的抗体的重链可变结构域(例如，骆驼科物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域)、鱼类中称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白(如鲨鱼血清中天然存在的IgNAR)中的VH样单结构域、和衍生自它们的经重组的单结构域抗原结合位点(例如，骆驼化的人VH结构域、人源化的骆驼科抗体重链可变结构域)，例如，所述单结构域抗原结合位点选自骆驼科物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域、骆驼化的人VH结构域和人源化的骆驼科抗体重链可变结构域(它们简称为“VHH”)。3.根据权利要求1或2所述的抗体分子，其中所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，优选地，所述免疫球蛋白是IgG1免疫球蛋白，更优选地，所述免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白；所述免疫球蛋白的轻链型别是κ型或λ型，优选地为κ型。4.根据权利要求1－3中任一项所述的抗体分子，其中所述Fc结构域包含免疫球蛋白恒定部分的铰链区，并且所述抗体分子的重链彼此通过所述铰链区处的二硫键稳定缔合，例如，在所述抗体分子的重链的Fc结构域中包含具有“CPPC”氨基酸残基的铰链区，从而所述重链彼此通过所述铰链区处氨基酸残基之间形成的二硫键稳定缔合；优选地，所述抗体分子的重链在各自的Fc结构域中还分别包含Y349C和S354C或者S354C和Y349C(根据Kabat的“EU编号”)，从而所述抗体分子的重链彼此在Fc区进一步形成链间二硫键。5.根据权利要求1－4中任一项所述的抗体分子，其中所述Fc结构域中还包含影响抗体效应子功能的突变，例如，LALA突变。6.根据权利要求1－5中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子的重链在各自的Fc结构域中分别包含凸起或空穴，并且一条重链Fc结构域中的所述凸起或空穴可分别置于另一条重链Fc结构域中的所述空穴或凸起中，由此所述抗体分子的重链彼此形成“结入扣”的稳定缔合。7.根据权利要求1－6中任一项所述的抗体分子，其中所述免疫球蛋白CH1结构域和轻链恒定结构域(CL)中分别包含凸起或空穴，并且CH1结构域中的所述凸起或空穴可分别置于CL结构域中的所述空穴或凸起中，由此所述抗体分子的重链和轻链彼此形成“结入扣”的稳定缔合。8.根据权利要求1－7中任一项所述的抗体分子，其中所述(i)和(ii)分别结合相同抗原上的表位或者不同抗原上的表位，例如，所述(i)结合第一抗原的表位，所述(ii)结合第二抗原上的表位，由此，所述抗体分子是针对第一抗原和第二抗原的双特异性抗体。9.根据权利要求1－8中任一项所述的抗体分子，其中所述连接肽是单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基，例如，所述连接肽包含氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1－7中的正整数，例如，n是2。10.根据权利要求1－9中任一项所述的抗体分子，其中所述抗原是细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、配体、细胞表面受体或其片段。11.根据权利要求10所述的抗体分子，其中所述抗原选自肿瘤相关抗原、免疫检查点分子、血管新生诱导因子、肿瘤坏死因子受体超家族成员和免疫系统中的共刺激分子，以及这些分子的配体和/或受体。12.根据权利要求11所述的抗体分子，其中所述抗原选自OX40、CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、4-1BB(CD137)、VEGF和GITR。13.根据权利要求1－12中任一项所述的抗体分子，其是包含四条多肽链的抗体分子，其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链包含免疫球蛋白轻链以及位于所述免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)的N端的单结构域抗原结合位点，例如VHH；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链包含免疫球蛋白重链；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链包含免疫球蛋白轻链以及位于所述免疫球蛋白轻链恒定区(CL)的C端的单结构域抗原结合位点，例如VHH；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链包含免疫球蛋白重链；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链包含免疫球蛋白轻链；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链包含免疫球蛋白重链以及位于所述免疫球蛋白重链N端的单结构域抗原结合位点，例如VHH；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链包含免疫球蛋白轻链；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白重链可变区、免疫球蛋白CH1结构域、单结构域抗原结合位点(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3和任选地CH4结构域；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含单结构域抗原结合位点(例如VHH)、免疫球蛋白重链可变结构域(VH)和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任选地CH4结构域；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)、免疫球蛋白轻链恒定区(CL)和单结构域抗原结合位点(例如VHH)；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任选地CH4结构域；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含单结构域抗原结合位点(例如VHH)、免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)、免疫球蛋白CH1、CH2、CH3和任选地CH4结构域；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)、免疫球蛋白CH1结构域、单结构域抗原结合位点(例如VHH)、免疫球蛋白CH2、CH3和任选地CH4结构域；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含单结构域抗原结合位点(例如VHH)、免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)和免疫球蛋白CH1结构域；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)、免疫球蛋白轻链恒定区(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任选地CH4结构域；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)、免疫球蛋白CH1结构域和单结构域抗原结合位点(例如VHH)；第二多肽链和第四多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白重链可变结构域(VH)、免疫球蛋白轻链恒定区(CL)、免疫球蛋白CH2、CH3和任选地CH4结构域；或者其中第一多肽链和第三多肽链中的每一多肽链从N端至C端包含免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)和免疫球蛋白CH...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军建，缪小牛，匡智慧，
申请(专利权)人：信达生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32