本发明专利技术涉及鱼类基因工程技术领域，公开了一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性，鲤抗病毒蛋白Rhbdd3编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中第1‑1050bp所示的序列，其编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：2中所示的序列。本发明专利技术克隆的Rhbdd3蛋白的表达不仅可以抑制鲤春病毒血症病毒(SVCV)的增殖，而且还可以抑制传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的增殖。Rhbdd3蛋白在细胞抵御SVCV及IPNV的感染过程中发挥着重要作用，同时不影响细胞的正常活性。本发明专利技术的基因和蛋白为制备抗SVCV和IPNV药物提供了新的靶点，也为鱼类抗病毒新品种的培育提供了重要的技术依据。
Isolated carp antiviral protein Rhbdd3 and its antiviral activity
【技术实现步骤摘要】
分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性
本专利技术涉及淡水鱼类基因工程
，尤其涉及一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性。
技术介绍
伴随着我国水产养殖业的不断发展，水生动物疾病尤其是病毒性疾病的发病率近年来呈现明显的上升趋势。水生动物病毒病发病快、死亡率高、大多没有有效的疫苗或针对性的药物，一旦发病很难治愈，带来巨大的经济损失，严重制约着我国水产养殖业的健康和可持续发展。因此，开发广谱抗病毒药物和培育鱼类抗病毒新品种具有十分重要的实用价值。天然免疫是机体抵抗病毒侵袭的第一道防线，最新研究发现，Rhomboid家族成员Rhbdd3(Rhomboiddomain-containingprotein3)在哺乳动物天然免疫中发挥了重要作用。Rhomboid家族最先于果蝇中发现，其具有跨膜结构和蛋白酶活性。基于序列的相似性，目前共有14种蛋白归于Rhomboid家族，其中5种具有蛋白酶活性，9种则失去了蛋白酶活性。小鼠中研究发现，Rhbdd3主要分布于细胞内体且不具有蛋白酶活性，poly(I:C)处理会诱导小鼠NK细胞Rhbdd3的上调，Rhbdd3进而又可以调节NK细胞和树突状细胞的活性。然而，目前公共数据库中尚无鱼类Rhbdd3基因的确定序列，鱼类Rhbdd3蛋白的功能也尚未见任何报道。本专利技术首次通过PCR扩增获得了鲤Rhbdd3基因片段的核苷酸序列，并在此基础上构建了Rhbdd3真核表达质粒，转染鲤鱼上皮瘤细胞EPC和鲑鱼囊胚细胞CHSE-214后，探明了Rhbdd3蛋白过表达对危害重大的鱼类病毒—鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)增殖的影响。鲤春病毒血症(SVC)是一种由鲤春病毒血症病毒(SVCV)导致的急性暴发性出血症。该病常于春季在水温8～20℃，尤其是13～15℃时暴发流行。鲤、锦鲤、草鱼、鲫及其变种、鲢、鳙等多种鲤科鱼类均能被感染。病鱼常聚集于出水口处，体色发黑、眼球突出、肛门红肿、腹部膨大及严重腹水、呼吸缓慢、往往失去平衡而侧游。该病发病急、病鱼死亡率可高达90％左右，严重危害渔业生产并造成毁灭性打击。因其高致病性，SVC被世界动物卫生组织OIE列为必须申报的疫病，也是我国鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。2008年，农业部第1125号公告也将该其列为“中华人民共和国进境动物一类传染病”，也是迄今唯一一个被列为一类传染病的鱼类疫病。目前，尚缺乏有效控制SVC的药物和方法，国际上通行的控制措施是进行SVCV的监测，及早发现并进行隔离和扑杀。传染性胰腺坏死病毒(IPNV)为鲑科鱼类高度传染性疾病—传染性胰腺坏死病(IPN)的病原。IPN病往往呈急性流行，感染幼鱼死亡率超过90％。病鱼体色发黑、眼球突出、腹部膨大、皮肤和鳍条出血，组织切片可见胰腺组织坏死。该病常在水温10～15℃时流行，发病后幸存鱼成为IPNV携带者，并可以通过尿液、粪便、鱼卵、精液等将病毒释放到环境中继续传播。IPN最早在美国北部发现，随后在欧洲、日本等多国发生流行，并已于20世纪80年代传入我国，其暴发主要集中在我国东北地区虹鳟以及大西洋鲑的养殖场，且近些年来有逐步蔓延之势，对我国水产养殖业构成了巨大威胁。因此，本领域的技术人员致力于开发一种具有广谱抗病毒活性且不影响细胞正常活性的抗病毒蛋白，为危害性较大的鱼类传染性病原SVCV和IPNV的预防和治疗提供新的药物靶点，也为鱼类抗病毒新品种的培育提供重要的技术依据。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鲤抗病毒蛋白(Rhbdd3)，具有针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的抗病毒活性，能降低SVCV和IPNV感染性、抑制病毒复制，同时又不影响细胞的正常活性，为SVCV及IPNV的预防和治疗提供新的药物靶点，克服现有技术的不足。为实现上述目的，本专利技术提供了一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3基因，所述Rhbdd3基因编码区核苷酸序列是SEQIDNO：1中第1-1050bp所示的序列。本专利技术还提供了一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3，所述蛋白Rhbdd3编码的氨基酸序列是SEQIDNO：2中所示的序列。本专利技术还提供了一种包含所述Rhbdd3基因编码区核苷酸序列的重组质粒。本专利技术还提供了一种制备所述重组质粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤一、提取鲤的RNA，反转录所述RNA获得鲤cDNA；步骤二、设计Rhbdd3基因序列保守区的上游引物和下游引物，以所述步骤一获得的所述鲤cDNA为模板扩增，得到扩增片段，将其纯化回收并连接至pMD18-T载体上得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并筛选阳性克隆后，进行双向序列测定，获得Rhbdd3基因序列；步骤三、根据所述步骤二得到的所述Rhbdd3基因序列，设计Rhbdd3基因编码区的表达克隆正向引物和反向引物，以所述步骤一获得的所述鲤cDNA为模板扩增得到扩增片段，并将所述扩增片段进行分子克隆，得到重组质粒。进一步地，所述步骤三还包括在扩增前，需在所述表达克隆正向引物和反向引物上分别引入NheI、EcoRI酶切位点。进一步地，所述上游引物和下游引物分别为pMD18-Rhbdd3-F和pMD18-Rhbdd3-R，其中所述pMD18-Rhbdd3-F的DNA序列为ACCTCAATATGACAGCGTCGTAAAC，所述pMD18-Rhbdd3-R的DNA序列为TATCCCTGAGCTATGACGCTGA。进一步地，所述表达克隆正向引物和反向引物分别为pCI-Rhbdd3-F和pCI-Rhbdd3-R，其中所述pCI-Rhbdd3-F的DNA序列为TTAGCTAGCCACCATGCTCGATCATCTTTTTTCAGCAT，所述pCI-Rhbdd3-R的DNA序列为CGGAATTCCTATGACGCTGATGGCTTCTTCC。本专利技术还提供了一种如上所述的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3基因在制备抗鲤春病毒血症病毒药物组合物或抗传染性胰腺坏死病毒药物组合物中的应用。本专利技术还提供了一种如上所述的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3在制备抗鲤春病毒血症病毒药物组合物或抗传染性胰腺坏死病毒药物组合物中的应用。本专利技术还提供了一种如上所述的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3基因在培育鱼类抗病毒新品种中的应用。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益的技术效果：(1)本专利技术的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3的表达可以抑制SVCV和IPNV病毒的复制，降低SVCV和IPNV病毒的感染性；(2)本专利技术的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3的过表达不影响细胞的正常活性；(3)本专利技术的Rhbdd3蛋白基因和Rhbdd3蛋白高度保守，为制备广谱的抗病毒药物提供了新的靶点；(4)本专利技术的Rhbdd3蛋白基因和Rhbdd3蛋白为鱼类抗病毒新品种的培育提供了重要的技术依据。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术的一个较佳实施例的鲤Rhbdd3基因编码区的扩增结果示意图；图2是本专利技术的一个较佳实施例的鲑Rhbdd3基因编码区的扩增结果示意图；图3是本专利技术的一个较佳实施例的鲑Rhbdd3基因编码区的扩增序列比本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3基因，其特征在于，所述Rhbdd3基因编码区核苷酸序列是SEQ ID NO：1中第1‑1050bp所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3基因，其特征在于，所述Rhbdd3基因编码区核苷酸序列是SEQIDNO：1中第1-1050bp所示的序列。2.一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3，其特征在于，所述蛋白Rhbdd3编码的氨基酸序列是SEQIDNO：2中所示的序列。3.一种包含如权利要求1所述的Rhbdd3基因编码区核苷酸序列的重组质粒。4.一种制备如权利要求3所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一、提取鲤的RNA，反转录所述RNA获得鲤cDNA；步骤二、设计Rhbdd3基因序列保守区的上游引物和下游引物，以所述步骤一获得的所述鲤cDNA为模板扩增，得到扩增片段，将其纯化回收并连接至pMD18-T载体上得到连接产物，将所述连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并筛选阳性克隆后，进行双向序列测定，获得Rhbdd3基因序列；步骤三、根据所述步骤二得到的所述Rhbdd3基因序列，设计Rhbdd3基因编码区的表达克隆正向引物和反向引物，以所述步骤一获得的所述鲤cDNA为模板扩增得到扩增片段，并将所述扩增片段进行分子克隆，得到重组质粒。5.如权利要求4所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤三还包括在扩增前，需在所述表达克隆正向引物和反向引物上分...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵玲，汤茜，肖雨，
申请(专利权)人：上海市水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31
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