分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip及抗病毒活性制造技术

本发明专利技术涉及淡水鱼类基因工程技术领域，公开了一种分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip及抗病毒活性，鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中第1‑2610bp所示的序列，其编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：2中所示的序列。试验表明本发明专利技术克隆的Pdcd6ip蛋白的表达可以影响鲤春病毒血症病毒(SVCV)的增殖，且Pdcd6ip蛋白在细胞抵御SVCV的感染过程中发挥着重要作用，同时对于普通细胞的细胞活性的影响低。本发明专利技术的基因或蛋白为制备抗SVCV药物提供了新的靶点。

Isolated Cyprinus carpio antiviral protein Pdcd6ip and its antiviral activity

【技术实现步骤摘要】
分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip及抗病毒活性
本专利技术涉及淡水鱼类基因工程
，尤其涉及一种分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip及抗病毒活性。
技术介绍
我国为水产养殖大国，但是近些年来伴随着水产养殖业的不断发展，水生动物疾病尤其是病毒性疾病的发病率呈现明显的上升趋势。这对我国的水产养殖业及进出口贸易均造成了巨大的经济损失，严重制约着我国水产养殖业的健康和可持续发展。其中，鲤春病毒血症(Springviraemiaofcarp，SVC)是一种由鲤春病毒血症病毒(Springviraemiaofcarpvirus，SVCV)导致的暴发性出血症。该病是一种以出血为主要临床症状并伴有高度传染性的急性流行病，能在鲤、锦鲤、草鱼、鲢、鳙、鲫等多种鲤科经济鱼类和观赏鱼类发生明显症状。SVC常于春季在水温8～20℃，尤其是13～15℃时暴发流行，该病的暴发与水温和鱼体健康状况密切相关，水温越适宜、鱼体健康状况越差越容易感染。病鱼常聚集于出水口处，体色发黑，眼球突出，肛门红肿，腹部膨大及严重腹水，呼吸缓慢，往往失去平衡而侧游。该病发病急、死亡率可高达90％左右，严重危害渔业生产并造成毁灭性打击，因此世界动物卫生组织OIE将其列为必须申报的重要疫病。2008年，农业部第1125号公告更是将该病列为“中华人民共和国进境动物一类传染病”，也是迄今唯一被列为一类传染病的鱼类疫病，是我国鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。目前，国际上通行的控制该病的有效措施是进行鲤春病毒血症的监测，及早发现并进行隔离或扑杀，尚缺乏有效控制鲤春病毒血症的药物和方法。因此加强SVCV抗病毒机制的研究，寻求有效的预防和治疗方法具有极为重要的理论和实践意义。程序性细胞死亡6互作蛋白Pdcd6ip(Programmedcelldeath6-interactingprotein)，也称为Alix或Aip1，由pdcd6ip基因编码，是内吞体分选转运复合体III((EndosomalsortingcomplexesrequiredfortransportIII,ESCRT-III)的组成部分，还在调控程序性细胞死亡中起到了重要作用。研究表明，Pdcd6ip可以结合细胞凋亡相关蛋白ALG-2、ESCRT-III中的CIN85,endophilins,CHMP4B和Tsg101等蛋白。此外，Pdcd6ip可以结合病毒的晚期结构域，包括P(S/T)AP、YXXL、PPXY等，参与了有包膜病毒如人类免疫缺陷病毒HIV、马传染性贫血病毒EIAV等的出芽及水泡性口炎病毒VSV复制过程中核衣壳从内体到细胞质的转运。Pdcd6ip在多种分子机制中发挥了不可或缺的桥梁作用，而病毒成分细胞内的转运及完整病毒的出芽为病毒正常复制所必不可少。因此，Pdcd6ip在调节病毒感染和复制中具有重要作用，其表达与否及表达水平的高低将影响病毒的感染和复制。EIAV中研究表明，Pdcd6ip的过表达抑制了其复制。因此，本领域的技术人员致力于开发一种鲤抗病毒蛋白，具有针对鲤春病毒血症的抗病毒活性，降低SVCV感染性，抑制SVCV病毒复制功能，同时对于普通细胞的细胞活性的影响低，为SVCV病毒感染的治疗提供新的药物靶点。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鲤抗病毒蛋白(Pdcd6ip)，具有针对鲤春病毒血症的抗病毒活性，降低SVCV感染性，抑制SVCV病毒复制功能，同时也不会影响普通细胞的细胞活性，为SVCV的治疗提供新的药物靶点，克服现有技术的不足。为实现上述目的，本专利技术提供了一种分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip基因，所述Pdcd6ip基因的核苷酸序列是SEQIDNO：1中第1-2610bp所示的序列。本专利技术还提供了一种分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip，所述蛋白Pdcd6ip编码的氨基酸序列是SEQIDNO：2中所示的序列。进一步地，所述蛋白Pdcd6ip具有能够与鲤春病毒血症病毒(SVCV)基质蛋白M中的PPXY结构域结合的片段。本专利技术还提供了一种包含所述Pdcd6ip基因的核苷酸序列的重组表达质粒。本专利技术还提供了一种制备所述重组表达质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一、提取鲤的RNA，反转录所述RNA获得鲤总cDNA；步骤二、设计Pdcd6ip基因的正向引物和反向引物，以所述步骤一获得的所述鲤总cDNA为模板扩增，得到扩增产物；步骤三、将所述步骤二得到的所述扩增产物进行分子克隆，得到重组表达质粒。进一步地，所述步骤二还包括在扩增前，还需在所述鲤总cDNA的上下游分别引入NheI、EcoRI酶切位点。进一步地，正向引物和所述反向引物分别为pCI-Pdcd6ip-F和pCI-Pdcd6ip-R，其中pCI-Pdcd6ip-F的DNA序列为TTAGCTAGCCACCATGGCGACGTTTATTTCTGTC，所述pCI-Pdcd6ip-R的DNA序列为CGGAATTCCTACTGTTGGGGGTAGTAGGGCT。进一步地，所述扩增产物为2610bp的DNA片段。本专利技术还提供了一种所述鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip基因在制备抗鲤春病毒血症病毒药物组合物中的应用。本专利技术还提供了一种所述鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip在制备抗鲤春病毒血症病毒药物组合物中的应用。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益的技术效果：(1)本专利技术的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip的表达可以影响鲤春病毒血症病毒(SVCV)的增殖，且抑制了SVCV病毒的复制功能，降低了SVCV病毒的感染性；(2)本专利技术的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip的过表达对于普通细胞的细胞活性的影响极低；(3)本专利技术的Pdcd6ip基因和Pdcd6ip蛋白为制备抗鲤春病毒血症病毒药物提供了新的靶点。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术的一个较佳实施例的Pdcd6ip基因片段的扩增结果示意图；图2是本专利技术的一个较佳实施例的利用免疫印迹法检测Pdcd6ip过表达情况的结果示意图；图3是本专利技术的一个较佳实施例的利用细胞增殖/毒性检测试剂CCK-8检测Pdcd6ip过表达对细胞活性的影响结果数据图；图4是本专利技术的一个较佳实施例的利用间接免疫荧光法检测Pdcd6ip蛋白对病毒感染的影响的荧光成像图片；图5是本专利技术的一个较佳实施例的利用荧光定量PCR检测Pdcd6ip蛋白对病毒增殖的影响结果数据图；图6是本专利技术的一个较佳实施例的应用的pCI-neo空载体的结构示意图谱；图7是本专利技术的一个较佳实施例的制备的重组表达质粒pCI-Pdcd6ip的结构示意图谱；图8是本专利技术的一个较佳实施例的制备的重组表达质粒pCI-flag-Pdcd6ip的结构示意图谱。具体实施方式以下参考说明书附图介绍本专利技术的多个优选实施例，使其
技术实现思路
更加清楚和便于理解。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。(1)鲤的RNA提取采用经典的Trizol法提取待测样品总RNA。取鲤组织块用眼科剪剪碎后直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，研磨充分后转入离心管，取50-100mg组织加入1mLTrizol，混匀，室温(15-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip基因，其特征在于，所述Pdcd6ip基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中第1‑2610bp所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip基因，其特征在于，所述Pdcd6ip基因的核苷酸序列是SEQIDNO：1中第1-2610bp所示的序列。2.一种分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip，其特征在于，所述蛋白Pdcd6ip编码的氨基酸序列是SEQIDNO：2中所示的序列。3.如权利要求2所述的分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip，其特征在于，所述蛋白Pdcd6ip具有能够与鲤春病毒血症病毒(SVCV)基质蛋白M中的PPXY结构域结合的片段。4.一种包含如权利要求1所述的Pdcd6ip基因的核苷酸序列的重组表达质粒。5.一种制备如权利要求4所述的重组表达质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一、提取鲤的RNA，反转录所述RNA获得鲤总cDNA；步骤二、设计Pdcd6ip基因的正向引物和反向引物，以所述步骤一获得的所述鲤总cDNA为模板扩增，得到扩增产物；步骤三、将所述步骤二得到的所述扩增产物进行分子克隆，得到重...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵玲，汤茜，肖雨，
申请(专利权)人：上海市水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31