一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗，其包含载体和ORF66基因的核酸分子，所述ORF66基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述载体为pVAX1。本发明专利技术制备得到的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗更加安全可靠，具有很好的免疫保护性，可以抑制鲤疱疹病毒II型对鲫鱼的感染，降低鲫鱼养殖过程中因病害导致的经济损失。养殖过程中因病害导致的经济损失。养殖过程中因病害导致的经济损失。

【技术实现步骤摘要】
一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鲫鱼(Carassiu sauratus)是我国重要的淡水养殖品种之一。鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2，CyHV
‑
2)所引发的鲫疱疹病毒病(也称鲫造血器官坏死病)已成为严重危害我国鲫鱼养殖业健康发展的重要疾病之一。鲤疱疹病毒Ⅱ型能感染鲫及其变种，常于水温15～25℃发病，在全球多个国家和地区都有流行，致死率高达90％。近年来，我国江苏、北京、广州、武汉等地均陆续暴发了由CyHV
‑
2感染导致的异育银鲫大规模死亡病例，造成了重大的经济损失。免疫接种是预防水生动物疾病发生、保障水产养殖业持续发展的有效途径。然而，目前针对CyHV
‑
2尚无有效的商业化疫苗或治疗药物，因此研制安全有效的鲤疱疹病毒Ⅱ型保护性疫苗对于防控鲫疱疹病毒病的暴发和流行具有重要意义。
[0003]DNA疫苗也称核酸疫苗、基因疫苗，是将含有编码保护性抗原蛋白的基因序列和表达所必需调控元件的质粒DNA导入动物组织后，被宿主细胞摄取、表达、加工并呈递给免疫系统，诱发机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，形成对该抗原的免疫保护作用。DNA疫苗制作相对简单、成本低廉、容易运输储存、不存在毒力返强现象、免疫途径多样，具有广阔的应用前景。
[0004]用于构建DNA疫苗的表达载体必须兼具安全性和有效性，即表达载体不会整合到宿主细胞的基因组中，并且其所携带的抗原基因能在动物细胞内获得适量表达并激发宿主产生免疫应答。鱼用DNA疫苗常用的质粒载体有pcDNA3.1(+)、pET
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32a、pEGFP
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N1等。pVAX1载体是由美国食品和药品管理委员会(FDA)推荐的唯一可以应用于人体实验的质粒载体。其具有以下优点：首先其仅保留真核表达最基本的DNA序列，以最大限度减少染色体整合的可能性。其次，因氨苄青霉素在部分机体中可诱发过敏反应，其采用卡那霉素抗性筛选基因作为替代，以最大程度地减少抗性筛选基因和人类基因组发生重组的可能性。基于此，哺乳动物中使用pVAX1载体构建核酸疫苗的应用较为广泛。然而，目前pVAX1载体在鱼用DNA疫苗开发中的应用报道较为少见。
[0005]本实验室前期对ORF66蛋白进行了原核表达，并制备了其特异性多抗，发现ORF66蛋白具有较好的免疫原性。本专利技术首次将ORF66蛋白编码基因构建至pVAX1真核表达载体，制备了一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗。本专利技术提供了一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的制备方法，并对其实际应用效果进行了检测。

技术实现思路

[0006]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何预防鲫鱼患上鲫疱疹病毒病。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗，其包含载体和
ORF66基因的核酸分子。
[0008]优选地，所述ORF66基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]优选地，所述载体为pVAX1。
[0010]在本专利技术的较佳实施方式中，专利技术提供了一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的制备方法，其包括以下步骤：以CyHV
‑
2的DNA为模板，以pVAX
‑
ORF66
‑
F/pVAX
‑
ORF66
‑
R为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pVAX1连接，构建质粒载体疫苗；
[0011]所述pVAX
‑
ORF66
‑
F如SEQ ID NO:2所示，
[0012]所述pVAX
‑
ORF66
‑
R如SEQ ID NO:3所示。
[0013]具体地，一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
[0014](3)采用病毒DNA提取试剂盒提取CyHV
‑
2感染组织中病毒DNA，以其作为模板，以pVAX
‑
ORF66
‑
F/pVAX
‑
ORF66
‑
R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0015](4)用DNA胶回收试剂盒对(1)中所述PCR扩增产物进行切胶纯化回收，然后分别将回收的片段和pVAX1载体用Hind III和Bam HI限制性内切酶37℃酶切3h，酶切片段纯化回收，在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆并进行双向序列测定，测序正确的重组质粒即为pVAX
‑
ORF66。
[0016]优选地，所述PCR反应体系如下：ddH2O 30.5μL、10
×
LA Buffer II(Mg
2+
plus)5μL、dNTP Mixture(2.5mmol/L)8μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、LA Taq Polymerase(5U/μL)0.5μL、DNA模板2μL，总体积为50μL。
[0017]优选地，所述PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
[0018]在本专利技术的另一较佳实施方式中，本专利技术提供一种药物组合物，其包含鲤疱疹病毒II型DNA疫苗。
[0019]在本专利技术的又一较佳实施方式中，本专利技术提供了鲤疱疹病毒II型DNA疫苗用于制备治疗鲫疱疹病毒病药物的应用。
[0020]本专利技术制备得到的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗更加安全可靠，具有很好的免疫保护性，可以抑制鲤疱疹病毒II型对鲫鱼的感染，降低鲫鱼养殖过程中因病害导致的经济损失。
[0021]以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
附图说明
[0022]图1是本专利技术的一个较佳实施例的鲤疱疹病毒II型ORF66基因编码区的扩增结果示意图；
[0023]图2是本专利技术的一个较佳实施例的构建的重组质粒pVAX
‑
ORF66限制性内切酶双酶切的结果示意图；
[0024]图3是本专利技术的一个较佳实施例的利用间接免疫荧光法检测ORF66蛋白在细胞中过表达的结果示意图；
[0025]图4是本专利技术的一个较佳实施例的利用RT
‑
PCR检测ORF66在鲫鱼体内转录表达的结果示意图；
[0026]图5是本专利技术的一个较佳实施例的利用免疫印迹法检测ORF66蛋白在鲫鱼体内表
达的结果示意图；
[0027]图6是本专利技术的一个较佳实施例的不同实验组攻毒后存活率曲线图；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲤疱疹病毒II型DNA疫苗，其包含载体和ORF66基因的核酸分子。2.根据权利要求1所述的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于，所述ORF66基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于，所述载体为pVAX1。4.权利要求1
‑
3任一所述的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以CyHV
‑
2的DNA为模板，以pVAX
‑
ORF66
‑
F/pVAX
‑
ORF66
‑
R为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pVAX1连接，构建质粒载体疫苗；所述pVAX
‑
ORF66
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F如SEQ ID NO:2所示，所述pVAX
‑
ORF66
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R如SEQ ID NO:3所示。5.根据权利要求4所述的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用病毒DNA提取试剂盒提取CyHV
‑
2感染组织中病毒DNA，以其作为模板，以pVAX
‑
ORF66
‑
F/pVAX
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ORF66
‑
R为引物进...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵玲，施永海，张明辉，刘亚楠，
申请(专利权)人：上海市水产研究所，
类型：发明
国别省市：