一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV

【技术实现步骤摘要】
一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子的制备与应用


[0001]本专利技术涉及疫苗制备
，尤其是涉及一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子的制备与应用。

技术介绍

[0002]Ⅰ型牛疱疹病毒(BoHV
‑
1)主要通过呼吸道、生殖道等粘膜系统感染、在体内躲过机体免疫系统，进入宿主细胞内复制增殖，进而在体内扩散，最终到达三叉神经节处定植。在机体免疫力低下时，再次反复感染，而引起发病和疾病传播。由此，开发通过呼吸道或者生殖道免疫的疫苗的同时，还需要开发通过粘膜系统进入体内引起体液和细胞免疫的疫苗，才能从根本上预防病毒。
[0003]目前，灭活疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗、亚单位疫苗均不能达到以上目的。近年来，纳米材料为药物和疫苗递送研究提供了全新的设计思路。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子的制备与应用，选定BoHV
‑
1gB、gC和gD蛋白作为亚单位疫苗抗原，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV
‑
1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子的制备，步骤如下：
[0006]S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因
[0007]按照GeneBank公布的BoHV
‑
1gB、gC、gD基因序列，合成各个基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位点，其下游加入AgeⅠ酶切位点，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位点，其下游加入BSTBⅠ酶切位点；
[0008]S2、构建真核表达重组质粒
[0009]合成基因与pcDNA4
‑
Myc
‑
his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4
‑
gB
‑
his/pcDNA4
‑
gC
‑
his/pcDNA4
‑
gD
‑
his真核表达质粒，真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biological tool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒；
[0010]S3、真核表达质粒转染MDBK细胞
[0011]用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系；
[0012]S4、构建真核表达细胞系
[0013]转染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培养基37℃5％CO2培养48h将未转染成功的细胞杀死；
[0014]S5、真核表达蛋白纯
[0015]收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000*g离心30
分钟沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化；
[0016]S6、真核表达蛋白鉴定；
[0017]S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子制备。
[0018]优选的，步骤S3中，转染细胞系的操作如下：
[0019]A、贴壁转染
[0020]1)细胞按照传代步骤操作，105个/mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染；
[0021]2)DNA与PEI磁珠无菌混合后用无菌ddH2O稀释5倍后备用；
[0022]3)消化后细胞弃去原培养基，无菌PBS清洗2遍；
[0023]4)将2)步磁珠加入到3)步细胞中，37℃CO2培养箱中培养20
‑
30min；
[0024]5)加入正常的培养基继续培养，按正常传代操作进行；
[0025]B、悬浮转染
[0026]1)贴壁细胞消化后，300
×
g/min离心5min沉淀细胞弃掉培养基PBS清洗2遍在离心管中备用；
[0027]2)将DNA和磁珠按附表比例混合后，用无菌ddH2O稀释5倍后备用；
[0028]3)将上步混合物加入细胞中吹打悬浮细胞；
[0029]4)上步混合物放入培养箱培养20
‑
30min；
[0030]5)加入新鲜培养基转移到培养瓶或者培养皿中继续培养传代。
[0031]优选的，步骤S5中，用镍磁珠对his标签蛋白进行纯化步骤如下：
[0032]1)磁珠洗涤：将磁珠用磁铁吸附后加入适当体积2
×
binding&wash buffer洗涤2次，洗去磁珠保存液；
[0033]2)待纯化样品加入等体积的lysis buffer之后颠倒混匀；
[0034]3)磁珠颠倒混匀后取适量体积磁珠加入上一步样品中，颠倒混匀3min；
[0035]4)磁铁吸附磁珠，待磁珠吸附完全样品澄清后弃掉样品保留磁珠；
[0036]5)加入5mL 2
×
binding&wash buffer摇晃混匀后，磁铁再次吸附磁珠，重复3次弃液体；
[0037]6)将上一步残余液体用移液器吸干后加入his elution buffer 1mL浸泡磁珠2分钟后，磁铁吸附磁珠，收集液体放入另一个新的离心管中；
[0038]7)重复步骤5)两次后，5mL水保存磁珠。
[0039]优选的，步骤S6中，真核表达蛋白鉴定中操作如下：
[0040]a、真核表达蛋白纯度鉴定：将纯化后的蛋白跑SDS
‑
page电泳并转膜用小鼠抗his标签单抗做Western blotting鉴定表达蛋白纯度；
[0041]b、真核表达蛋白抗原性鉴定：将转染成功MDBK细胞0.25％胰酶消化后，转入24孔板培养贴壁后用4％多聚甲醛固定30min，1％BSA室温封闭2h加入兔抗BoHV
‑
1多克隆抗体室温孵育30min，PBST清洗5次，每次5min，加入FITC标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育30min后再清洗5次，荧光显微镜观察并记录蛋白表达情况。
[0042]优选的，步骤S7中，右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子制备过程如下：
[0043]A、磁珠最大偶联蛋白量确定
[0044]取1mL 50纳米羧基右旋糖酐磁珠磁珠梯度加入1:1:1混合的gB、gC、gD蛋白，分别以40μg、50μg、60μg、70μg、80μg加入1mg/mL的EDC活化剂室温孵育1h，10000
×
g离心20分钟
沉淀磁珠，取上清测定上清中蛋白浓度，确定饱和偶联最佳偶联量；
[0045]B、PEG600最佳包裹量确定
[0046]将上步偶联好蛋白的磁珠离心用PBS清洗2次，梯度加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤如下：S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因按照GeneBank公布的BoHV
‑
1gB、gC、gD基因序列，合成各个基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位点，其下游加入AgeⅠ酶切位点，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位点，其下游加入BSTBⅠ酶切位点；S2、构建真核表达重组质粒合成基因与pcDNA4
‑
Myc
‑
his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4
‑
gB
‑
his/pcDNA4
‑
gC
‑
his/pcDNA4
‑
gD
‑
his真核表达质粒，真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biological tool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒；S3、真核表达质粒转染MDBK细胞用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系；S4、构建真核表达细胞系转染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培养基37℃5％CO2培养48h将未转染成功的细胞杀死；S5、真核表达蛋白纯收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000
×
g离心30分钟沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化；S6、真核表达蛋白鉴定；S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子制备。2.根据权利要求1所述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV
‑
1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤S3中，转染细胞系的操作如下：A、贴壁转染1)细胞按照传代步骤操作，105个/mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染；2)DNA与PEI磁珠无菌混合后用无菌ddH2O稀释5倍后备用；3)消化后细胞弃去原培养基，无菌PBS清洗2遍；4)将2)步磁珠加入到3)步细胞中，37℃CO2培养箱中培养20
‑
30min；5)加入正常的培养基继续培养，按正常传代操作进行；B、悬浮转染1)贴壁细胞消化后，300
×
g/min离心5min沉淀细胞弃掉培养基PBS清洗2遍在离心管中备用；2)将DNA和磁珠按附表比例混合后，用无菌ddH2O稀释5倍后备用；3)将上步混合物加入细胞中吹打悬浮细胞；4)上步混合物放入培养箱培养20
‑
30min；5)加入新鲜培养基转移到培养瓶或者培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪宏波，刘行波，翟军军，叶超，王金良，张晓轩，
申请(专利权)人：榆林学院西南大学，
类型：发明
国别省市：