家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用制造技术

本发明专利技术公开了家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用，家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，通过在细胞水平和转基因家蚕水平增量表达家蚕Bmhsp19.9基因，能够提高细胞和转基因家蚕在高温胁迫下的存活率，同时能够提高转基因家蚕在低温环境下的生长速度，因此Bmhsp19.9基因是一个影响家蚕对极端环境温度耐受力的关键基因，可为家蚕转基因抗性品种的培育提供理论基础和靶标基因；本发明专利技术还提供了家蚕Bmhsp19.9基因的启动子，可以在极端温度下调控下游基因的表达。

Application of Bmhsp19.9 Gene in Breeding Silkworm Varieties with Extreme Temperature Tolerance

【技术实现步骤摘要】
家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用，还涉及培育对极端温度耐受家蚕品种的方法，以及极端温度调控Bmhsp19.9基因表达的启动子。
技术介绍
家蚕是一种重要的经济昆虫，蚕丝是丝绸工业的重要原料。在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。家蚕是变温动物，其生长、发育、繁育都受到环境温度的影响。家蚕的最适饲养温度为25℃，剧烈的环境温度变化会给养蚕业带来严重影响。低温引起家蚕生长缓慢、发育不整齐；高温导致各种蚕病的发生，降低蚕茧产量及茧丝质量。由于剧烈变化的环境温度对养蚕业的严重危害，科研工作者一直希望找出影响家蚕对极端环境温度抗性的关键基因，然后通过分子生物技术来提高家蚕对极端环境温度的抗性。对影响家蚕极端环境温度耐受性的关键基因全长序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗剧烈环境温度变化的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用；本专利技术克隆了家蚕Bmhsp19.9基因，RT-PCR结果显示该基因在家蚕发育的各时期都表达，且在家蚕精巢中高量表达，被高温(37℃)和低温(13℃)诱导上调表达；构建hsp19.9P1和hsp19.9P2分别介导Bmhsp19.9增量表达的瞬时转染载体，转染BmE细胞后，qPCR和WesternBlot检测都证明hsp19.9P1的活性高于hsp19.9P2。利用hsp19.9P1介导Bmhsp19.9在BmE细胞中增量表达，在高温处理后的细胞存活率显著高于对照。构建hsp19.9P1介导Bmhsp19.9增量表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕，和非转基因对照相比，转基因家蚕在高温处理后的死亡率显著降低，在低温饲养条件下的存活率和幼虫体重显著增加，发育更快。这些结果说明Bmhsp19.9基因是一个影响家蚕对极端环境温度耐受力的关键基因，可作为家蚕转基因抗性品种培育的靶标基因。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用，所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。优选的，所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法为在家蚕中通过家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9超量表达，所述家蚕hsp19.9启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.12或SEQIDNO.13所示。优选的，所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法，构建家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕，获得在增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的家蚕。优选的，所述家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体由以下方法制备：(1)以SEQIDNO.14和SEQIDNO.15为引物克隆然后以含Bmhsp19.9基因的质粒为模板进行扩增，扩增产物经BamHI和NotI酶切后连入经同样酶切的1180-hr3-39KP-ep32-SV40载体，得到1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体；(2)以家蚕基因组DNA为模板，克隆如SEQIDNO.12所示的家蚕hsp19.9启动子，然后将hsp19.9启动子连入1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体的SalI和BamHI酶切位点处，得到1180-hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40载体；(3)将步骤(2)得到的1180-hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40载体用AscI单酶切，然后与经AscI单酶切piggyBac[3×p3DsRedafm]的载体连接，获得转基因载体piggyBac[hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40-3×p3DsRedafm]。优选的，所述低温为低于25℃、高于或等于13℃；所述高温为高于25℃、低于或等于37℃。本专利技术的目的之二在于提供一种制备对极端温度耐受家蚕品种的方法，提供如下技术方案：一种制备对极端温度耐受家蚕品种的方法，具体步骤如下：在家蚕中通过家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9超量表达，所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述家蚕hsp19.9启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.12或SEQIDNO.13所示。优选的，具体步骤如下：构建家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕即可。进一步优选，(1)首先根据家蚕基因组序列设计特异引物，以家蚕5龄3天的全蚕cDNA为模板扩增Bmhsp19.9，以全蚕基因组DNA为模板扩增hsp19.9P1和hsp19.9P2，获得了目的条带，PCR产物回收后与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明Bmhsp19.9基因的全长序列及启动子hsp19.9P1、hsp19.9P2被成功克隆，克隆获得了534bp的Bmhsp19.9基因CDS全长序列，及1441bp的hsp19.9P1启动子序列和417bp的hsp19.9P2启动子序列；(2)以Bmhsp19.9基因的全长CDS序列作为靶标，设计N端含Flag标签和C端含His标签的增量表达引物，以克隆的Bmhsp19.9基因的CDS质粒为模板进行PCR扩增，对目的条带进行回收、连接和转化，筛选阳性克隆后测序。利用1180空载构建包括Hr3增强子、hsp19.9P1(或hsp19.9P2)启动子、Bmhsp19.9基因(含Flag和His标签)以及SV40终止信号序列的瞬时增量表达载体P1hsp19.9和P2hsp19.9；将hr3-hsp19.9P1-Bmhsp19.9-SV40添加到pBac[3×p3DsRedafm]构建转基因增量表达载体pb-H19.9。(3)将家蚕品种P50通过15℃低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后2h-4h用显微注射仪内将3-4nl、总浓度为400ng/ul的混合质粒(增量表达载体pb-H19.9和辅助质粒按1:1混合)注射进蚕卵蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住；将完成注射的蚕卵在35％的甲醛蒸汽中消毒4min后，置于25℃、相对湿度为80％的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的G1代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因品系H19.9A和H19.9B正常饲养，继代扩大群体数量。(4)取转基因系统H19.9A和H19.9B及非转基因P50的3龄和4龄起蚕用于qPCR检测，取H19.9A和对照5龄家蚕的多个组织进行qPCR和WesternBlot检测，结果显示转基因家蚕体内Bmhsp19.9表达量显著高于对照。(5)将转基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用，其特征在于：所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.增量表达家蚕Bmhsp19.9基因在培育对低温或高温耐受的家蚕品种中的应用，其特征在于：所述家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法为在家蚕中通过家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9超量表达，所述家蚕hsp19.9启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.12或SEQIDNO.13所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的方法，构建家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体，通过胚胎显微注射制备转基因家蚕，获得在增量表达家蚕Bmhsp19.9基因的家蚕。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述家蚕hsp19.9启动子介导家蚕Bmhsp19.9表达的转基因载体由以下方法制备：(1)以SEQIDNO.14和SEQIDNO.15为引物克隆然后以含Bmhsp19.9基因的质粒为模板进行扩增，扩增产物经BamHI和NotI酶切后连入经同样酶切的1180-hr3-39KP-ep32-SV40载体，得到1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体；(2)以家蚕基因组DNA为模板，克隆如SEQIDNO.12所示的家蚕hsp19.9启动子，然后将hsp19.9启动子连入1180-hr3-Bmhsp19.9-SV40载体的SalI和BamHI酶切...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋亮，王玉梅，郭慧珍，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50