水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法，该试剂包括清洗液、溶解液、裂解液、洗涤液和洗脱液；清洗液含有Tris和EDTA；溶解液含有柠檬酸三钠、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠；裂解液含有NaCl、Tris、柠檬酸钠、CaCl2和EDTA；洗涤液含有NaCl和Tris；洗脱液是去离子水。目前仍未有针对水稻根际铁膜微生物DNA的提取方法，利用本发明专利技术提供的方法提取出的DNA完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。提取出的DNA可达到对16S rRNA和aioA等基因的定量及高通量测序要求。

DNA Extraction Reagent and Method of Rice Rhizosphere Iron Film Microorganisms

【技术实现步骤摘要】
水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法
本专利技术属于基因组提取领域，涉及一种水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂及提取方法。
技术介绍
水稻的茎和根系具有发达的通气组织，可将叶片光合作用制造的氧气及从外部环境中摄入的氧气输送到根部，以供处于厌氧条件下的根系进行呼吸。同时，向根系输送的氧气会有一部分渗出根的皮层细胞向根际环境扩散，在植物根际周围形成微氧区域，使植物根系处于相对氧化的状态。厌氧土壤中二价铁离子(Fe2+)被水稻根系分泌的氧气和氧化性物质氧化，形成大量的红褐色或者黄色铁氧化物及其氢氧化物覆盖在根表上，即铁膜。水稻根表铁膜一般出现在距根尖1.0cm的地方，主要出现在根毛区、根伸长区及根上较靠后部的部位。影响水稻根表铁形成的因素包括：土壤溶液中Fe2+浓度、根系分泌的氧气和氧化性物质总量以及由此形成的微氧化环境、土壤中无机碳、可溶性盐、土壤有机质、阳离子交换量、碳酸盐含量、pH值、Eh值、生长季节、温度和淹水时间长短等。根表铁膜主要由晶态或无定态铁的氧化物或氢氧化物(如氢氧化铁、纤铁矿与针铁矿)组成。根表铁膜由于含有铁氧化物，可吸附根际环境的金属、类金属元素，作为水稻对重金属吸收的一种有效屏障。根表铁膜缓解植物受到金属毒害的机制主要有两个方面：一方面即为铁膜的物理化学吸附能力能使有毒元素束缚在植物根表不易被植物吸收；另一方面则是铁膜能提供除有毒元素外的其他元素离子进入植物体内，预先饱和有毒元素的结合位点，减少对有毒离子对植物的毒害。水稻根系作为污染物进入植物体内的重要门户，研究根表铁膜的作用机理及其形成的调控机制有重要意义，为正确评价重金属迁移转化行为提供合理的依据。现有的研究表明微生物广泛参与了铁膜形成以及其表面元素循环过程。铁氧化细菌和甲烷氧化细菌对于根表铁膜的形成起到了一定的作用。目前针对根表铁膜微生物的研究主要方法为显微观察和富集培养等方面。然而可培养的微生物只占到自然界微生物总量的1％不到。需要全面了解水稻根表铁膜相关微生物就需要利用基于现代分子生物学技术的非培养方法，此类方法需要提取到高质量的环境DNA。由于铁膜具有两性，能吸附带有正负电荷的基团及其离子，并且铁膜上往往吸附有大量的重金属，影响着DNA提取溶液离子形态以及细菌裂解，释放的DNA也可能被铁膜所吸附，如此造成铁膜DNA提取的困难。
技术实现思路
本专利技术的首要目的提供一组用于水稻根表铁膜微生物DNA提取的试剂，本申请从水稻根际铁膜环境(与水稻根际吸附紧密)及组成(铁氧化物浓度高)特征出发，针对野外样品保存、铁膜分离溶解、微生物滤膜回收、细胞裂解及DNA提取过程对所需试剂做了较大改进。本专利技术的另一目的在于提供上述试剂在水稻根表铁膜微生物DNA提取中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一组用于水稻根表铁膜微生物DNA提取的试剂，包括清洗液(FPCB)、溶解液(FPDB)、裂解液(FPLB)、洗涤液(FPWB)和洗脱液(FPEB)；该组试剂是根据水稻根际铁膜环境(与水稻根际吸附紧密)及组成(铁氧化物浓度高)特征设计得，其中的清洗液(FPCB)用于洗去根际表面土壤；裂解液(FPLB)用于裂解吸附于铁膜上的微生物细胞；洗涤液(FPWB)用于洗去裂解液中可能存在的大量铁等金属离子。所述的清洗液(FPCB)含有10～15mMTris、1～2mMEDTA(乙二胺四乙酸)，pH值为7～8。所述的溶解液(FPDB)含有20～30mM柠檬酸三钠、100～150mM碳酸氢钠和50～100mM连二亚硫酸钠，pH值7～8；所述的裂解液(FPLB)含有100～200mMNaCl、100～200mMTris、1～2mM柠檬酸钠、10～20mMCaCl2和50～100mMEDTA，pH值7～8；所述的洗涤液(FPWB)含有50～100mMNaCl和10～20mMTris，pH值7～8；所述的洗脱液(FPEB)是去离子水，pH值7～8；优选含有5～10mMTris。上述的试剂可用于提取水稻根表铁膜微生物的DNA，具体包括以下步骤：(1)野外采集水稻根部样品，去除根际土后，放入容器中，冰上保存运回实验室；(2)加入去离子水浸没水稻根部，震荡培养，然后倒掉去离子水，重复该操作若干次，直至水稻根部表面土壤被去除干净；(3)加入清洗液，震荡，然后倒掉清洗液，重复该操作若干次，去除铁膜表面吸附的金属离子；(4)加入溶解液，放入55～60℃水浴几个小时，该步用于溶解根表铁膜；然后将该溶解液用滤膜过滤，以去除溶液里面的离子成分，保留微生物及颗粒铁氧化物；步骤(4)所述的滤膜为混合纤维素滤膜或玻璃纤维素膜，其孔径优选0.22μm；(5)取滤膜，加入液氮，研磨至滤膜破碎为止，加入直径为0.7mm和0.15mm的石榴石，并加入裂解液，震荡5～10分钟；再加入溶菌酶，35～37℃水浴0.5～1.0小时；然后再加入蛋白酶K和SDS，35～40℃摇床震荡0.5～1.0小时，后放入60～65℃水浴锅中水浴1～2个小时；该步骤中，采用两种粒径的石榴石对微生物细胞的破碎效果比采用单一粒径的好；步骤(5)中，滤膜与两种石榴石的重量比为1.0:(1.0-1.5):(1.0-1.5)；(6)水浴后的溶液放入细胞破碎仪中进一步裂解细胞，然后离心，取上清液；加入与上清液相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，上下颠倒混匀，并震荡几十秒，再次离心，取上清液；步骤(6)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心15～20分钟；步骤(6)所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿、异戊醇三者的体积比为25:24:1；(7)加入与上清液相同体积的无水乙醇，混匀后转移至硅胶膜离心柱；加入2倍上清液体积的洗涤液，抽吸滤过，该加入清洗液和抽吸滤过的操作重复若干次；(8)用乙醇溶液洗涤离心柱，然后将离心柱离心，甩干硅胶薄膜上的乙醇；往离心柱中加入预热的洗脱液，室温孵育几分钟，然后离心，沉淀即为水稻根表铁膜微生物的DNA；步骤(8)所述的乙醇溶液，其体积百分比为70～75％；步骤(8)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心2～10分钟；步骤(8)所述的预热，优选65℃预热。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：目前仍未有针对水稻根际铁膜微生物DNA的提取方法，利用本专利技术提供的方法提取出的DNA完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。提取出的DNA可达到对16SrRNA和aioA等基因的定量及高通量测序要求。附图说明图1是水稻铁膜实物图。图2是水稻铁膜微生物DNA琼脂糖凝胶电泳结果。图3是水稻铁膜微生物16SrRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。图4是水稻铁膜微生物微物种组成。图5是水稻铁膜aioA基因物种组成。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1一种水稻根际铁膜微生物DNA的提取试剂，包括清洗液FPCB、溶解液FPPB、裂解液FPLB、洗涤液FPWB、洗脱液FPEB。清洗液FPCB制备：称取1.2gTris，3gEDTA，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为7.5，加入去离子水定容至1L。溶解液FPPB制备：称取8.8g柠檬酸三钠,10.5g碳酸氢钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于水稻根表铁膜微生物DNA提取的试剂，其特征在于包括清洗液、溶解液、裂解液、洗涤液和洗脱液；所述的清洗液含有10～15mM Tris、1～2mM EDTA，pH值为7～8；所述的溶解液含有20～30mM柠檬酸三钠、100～150mM碳酸氢钠和50～100mM连二亚硫酸钠，pH值7～8；所述的裂解液含有100～200mM NaCl、100～200mM Tris、1～2mM柠檬酸钠、10～20mM CaCl2和50～100mM EDTA，pH值7～8；所述的洗涤液含有50～100mM NaCl和10～20mM Tris，pH值7～8；所述的洗脱液是去离子水，pH值7～8。

【技术特征摘要】
1.一组用于水稻根表铁膜微生物DNA提取的试剂，其特征在于包括清洗液、溶解液、裂解液、洗涤液和洗脱液；所述的清洗液含有10～15mMTris、1～2mMEDTA，pH值为7～8；所述的溶解液含有20～30mM柠檬酸三钠、100～150mM碳酸氢钠和50～100mM连二亚硫酸钠，pH值7～8；所述的裂解液含有100～200mMNaCl、100～200mMTris、1～2mM柠檬酸钠、10～20mMCaCl2和50～100mMEDTA，pH值7～8；所述的洗涤液含有50～100mMNaCl和10～20mMTris，pH值7～8；所述的洗脱液是去离子水，pH值7～8。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述的洗脱液含有5～10mMTris，pH值7～8。3.权利要求1或2所述的试剂在提取水稻根表铁膜微生物DNA中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括以下步骤：(1)野外采集水稻根部样品，去除根际土后，放入容器中，冰上保存运回实验室；(2)加入去离子水浸没水稻根部，震荡培养，然后倒掉去离子水，重复该操作若干次，直至水稻根部表面土壤被去除干净；(3)加入清洗液，震荡，然后倒掉清洗液，重复该操作若干次，去除铁膜表面吸附的金属离子；(4)加入溶解液，放入55～60℃水浴几个小时，该步用于溶解根表铁膜；然后将该溶解液用滤膜过滤，以去除溶液里面的离子成分，保留微生物及颗粒铁氧化物；(5)取滤膜，加入液氮，研磨至滤膜破碎为止，加入直径为0.7mm和0.15mm的石榴石，并加入裂解液，震荡5～10分钟；再加入溶菌酶，35～37℃水...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，刘传平，李芳柏，
申请(专利权)人：广东省生态环境技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44