本发明专利技术涉及一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，还包括溶菌剂Ⅱ、裂解吸附液和加强洗涤液，溶菌剂Ⅱ包括MES、EDTA、Triton X‑100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，裂解吸附液包括Tris‑HCl、氯化钠、EDTA、TrionX‑100以及核酸分离吸收促进剂；加强洗涤液包括Tris‑HCl、氯化锂和乙醇。采用本发明专利技术的试剂盒能够彻底破坏革兰氏阳性细菌和各种真菌的细胞壁，形成原生质体，在裂解吸附液的作用下迅速释放原生质体细胞DNA，并高效地吸附在硅胶磁珠上，经洗涤液洗涤并用洗脱液洗脱后，得到高浓度和纯度的微生物DNA。
A Kit and Method of Microbial Genome DNA Extraction by Magnetic Bead Method
【技术实现步骤摘要】
一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法
本专利技术涉及一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法，具体涉及一种高效提取各种样本中不同微生物(包括革兰氏阳性细菌和各种真菌)基因组DNA的硅胶磁珠提取试剂盒及方法属于生物
技术介绍
宏基因组学是当今世界科研最热门的研究领域之一。宏基因组是以样品中的微生物群体基因组为研究对象，以高通量测序为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系，以及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。传统的微生物学研究是建立在分离培养基础上的，但是现有的培养技术只能分离培养极少数已知的微生物。采用研究方法在微生物与疾病的关系上已很难有所突破，极大地限制了人们对微生物与疾病关系的认识，因此，宏基因组在医学上的应用也就越来越重要。宏基因组学在医学上的应用主要表现在：发现新的致病微生物；微生物群体多样性与疾病关系；微生物之间协作的致病机理；从微生物中发现有医学应用价值的生物活性物质(比如酶及抗生素等)；不可培养微生物耐药情况及其在耐药传播机制中的作用等。宏基因组学避免了传统微生物学研究的限制，为充分认识和利用微生物提供了可能，为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇。宏基因组学包括从样本中提取微生物基因组DNA、高通量测序分析和生物信息分析等工作。其前端关键性技术是微生物基因组DNA的提取，DNA提取方法的精确程度将直接决定微生物信息的精确度。运用现有的提取技术能够提取多少类型的微生物基因组，是否了导致“基因遗漏”的发生，这些我们仍然不清楚。临床微生物主要包括：病毒、支原体、衣原体、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和各种真菌，由于病毒、支原体、衣原体和革兰氏阴性细菌没有或者只有极薄的细胞壁，因此这些微生物基因组DNA的提取没有任何难度。而革兰氏阳性细菌和真菌含有较厚的细胞壁，细胞壁主要成分为多糖、蛋白质和脂类组成，这两类微生物基因组的提取首先必须完全破坏细胞壁，才能使基因组DNA充分释放。其中革兰氏阳性细菌细胞壁中的肽聚糖主要由β-1.4糖苷键组成，能被溶菌酶水解；真菌细胞壁中的肽聚糖主要由β-1.3和β-1.6糖苷键组成，能被溶壁酶水解。相对革兰氏阳性细菌来说，真菌的细胞壁厚约100-250nm，更厚更复杂，水解难度更高。目前微生物基因组DNA提取的技术壁垒主要是在同时破坏不同微生物的细胞壁这一关键环节。常用的破壁方法主要有液氮研磨法、玻璃珠破壁法、酶解法和氯化苄法等。通常液氮研磨法一般是直接在液氮中研磨；玻璃珠机械破壁法则加入石英砂、玻璃珠等来帮助破壁；氯化苄法是利用氯化苄、尿素来溶解细胞壁。此外，还有用超声波辅助破壁的方法，以及使用高速匀浆器破壁的方法。但以上这些方法有一定的缺点：1、致病微生物污染环境和感染工作人员的风险；2、细胞壁破坏不完全，基因组释放不充分，导致“基因遗漏”的发生；3、有毒害物质(氯化苄)对环境和工作人员的危害；4、液氮容易造成冻伤且不易获得。目前能够同时提取各种微生物包括真菌基因组DNA的产品主要为美国MoBioPowerSoil微生物提取试剂盒和OmegaFungalDNA提取试剂盒，由于其在微生物基因组DNA提取领域具有非常大的垄断性，因此价格十分昂贵。虽然价格昂贵，但是提取效果并不理想，而且提取试剂中含有有毒物质，对人员和环境容易造成危害。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供了一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法，提高了微生物基因组DNA的提取效率，且能够满足同时提取各种样本中不同微生物基因组DNA的目的。本专利技术采用如下技术方案：一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，还包括溶菌剂II、裂解吸附液和加强洗涤液，所述溶菌剂II包括2-吗啉代乙磺酸(2--Morpholinoethanesulfonicacid，MES)、EDTA、TritonX-100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，所述裂解吸附液包括Tris-HCl、氯化钠、EDTA、TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂；所述加强洗涤液包括Tris-HCl、氯化锂和乙醇。进一步的，所述溶菌剂II为10-500mM的MES，1-100mM的溶壁酶增强剂，5-150mM的EDTA，0.01％-5％的TritonX-100和0.1-10％的溶壁酶，所述溶菌剂II的pH5.5-8.0。进一步的，所述溶壁酶增强剂为三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride，TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。进一步的，所述裂解吸附液包括：10-100mMTris-HCl，0.5-1.5M氯化钠，1-20mMEDTA，0.1％-5％TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂，所述裂解吸附液的pH为6.0-9.0。进一步的，所述核酸分离吸附促进剂包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和硫脲。进一步的，所述加强洗涤液中包括10-100mMTris-HCl、0.5-2M氯化锂和50-70％乙醇，所述加强洗涤剂的pH6.5-7.5。采用权利要求1所述的一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒的提取方法：包括如下步骤：(1)将各种样本如革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和各种真菌放入微生物保存缓冲液中，充分混匀后离心，保留沉淀；(2)向沉淀中加入50-200μL的溶菌液Ⅰ，进行混匀和孵育处理，混匀时间为10-60s，孵育处理时间为10-60min，使革兰氏阳性细菌的细胞壁水解，得到混合物Ⅰ；(3)向混合物Ⅰ中加入50-200μL的溶菌液II，进行混匀和孵育处理，混匀的时长为10-60s，孵育处理时长为10-60min，使真菌细胞壁水解，得到混合物II；(4)向混合物II中加入的裂解吸附液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，混合物II与裂解吸附液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：100-300：200-600：5-20，使原生质体(细胞)DNA与结合蛋白分离，得到混合物Ⅲ，所述振荡速度为500-1500rpm，所述孵育处理温度为55-70℃，孵育处理时间为5-30min；(5)向混合物Ⅲ中加入异丙醇和硅胶磁珠进行振荡混匀，异丙醇的加入量与裂解吸附液的比例按照体积份数比为0.4-1.5：1，加入硅胶磁珠的量为5-20μL，使混合物Ⅲ中释放的DNA高效地吸附在硅胶磁珠上，所述振荡速度1500-3000rpm，所述孵育处理温度为15-30℃，所述孵育处理时长为1-10min；(6)吸附完成后，使用磁力架分离磁珠，磁力架吸附硅胶磁珠的时长为3-10min或至液体清澈，再依次使用洗涤液I和80％乙醇水溶液对硅胶磁珠分别进行洗涤后分离，洗涤液I使用量为0.5-1mL，对洗涤分离后的硅胶磁珠进行烘干，烘干温度为37-60℃，烘干时长为1-5min，得到去除杂质的含有原生质体(细胞)基因组DNA的硅胶磁珠；(7)利用洗脱液对硅胶磁珠进行振荡孵育洗脱，洗脱液的使用量为50-200μL，洗脱温度为37-60℃，振荡速度为500rpm-1500rpm，弃去磁力架分离的硅胶磁珠，收集洗脱液，得到基因组DNA。溶菌剂II中各组分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，其特征在于：还包括溶菌剂Ⅱ、裂解吸附液和加强洗涤液，所述溶菌剂Ⅱ包括MES、EDTA、Triton X‑100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，所述裂解吸附液包括Tris‑HCl、氯化钠、EDTA、TrionX‑100以及核酸分离吸收促进剂；所述加强洗涤液包括Tris‑HCl、氯化锂和乙醇。
【技术特征摘要】
1.一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，其特征在于：还包括溶菌剂Ⅱ、裂解吸附液和加强洗涤液，所述溶菌剂Ⅱ包括MES、EDTA、TritonX-100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，所述裂解吸附液包括Tris-HCl、氯化钠、EDTA、TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂；所述加强洗涤液包括Tris-HCl、氯化锂和乙醇。2.如权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述溶菌剂Ⅱ为10-100mM的MES，1-100mM的溶壁酶增强剂，5-150mM的EDTA，0.01％-5％的TritonX-100和0.1-10％的溶壁酶，所述溶菌剂Ⅱ的pH5.5-8.0。3.如权利要求2所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述溶壁酶增强剂为三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride，TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。4.如权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述裂解吸附液包括：10-100mMTris-HCl，0.5-1.5M氯化钠，1-20mMEDTA，0.1％-5％TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂，所述裂解吸附液的pH为6.0-9.0。5.如权利要求4所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述核酸分离吸附促进剂包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和硫脲。6.如权利要求1所述的用于不同微生物基因组DNA的磁珠法提取试剂盒，其特征在于：所述加强洗涤液中包括10-100mMTris-HCl、0.5-2M氯化锂和50-70％乙醇，所述加强洗涤剂的pH6.5-7.5。7.采用权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒的提取方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄学文，赵琪，安仙园，沈兰凤，胡仁静，
申请(专利权)人：无锡市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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