检测方法技术

本文提供了用于从人类或非人类动物粪便样品分离真核核酸的材料和方法。还提供了分析存在于人类或非人类动物粪便样品中的真核生物标志物的方法。

test method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年10月27日提交的美国临时申请第62/413,708号、2017年6月22日提交的美国临时申请第62/523,511号和2017年8月17日提交的美国临时申请第62/547,046号的优先权，所述临时申请的公开内容以全文引用的方式明确地并入本文中。
本专利技术涉及从粪便样品提取真核核酸和使用所述核酸诊断和治疗肠疾病。
技术介绍
胃肠病症，例如胃肠癌，和其它消化疾病，如炎性肠病、肠易激综合征和克罗恩病(Crohn'sdisease)，是普遍存在的。在美国，胃肠病症估计每年影响6000万至7000万人。对于一些病症，早期筛查和诊断已经使得患者的死亡率降低和生活品质提高。然而，标准诊断方法，如结肠镜检查，是侵入性的，耗时的，并且与相对高的成本相关。胃肠病症还可以影响动物，例如，作为宠物饲养的动物，如猫和狗。筛查此类病症的兽医学方法同样是侵入性的并且成本很高。一直需要在人类和动物中诊断胃肠病症的非侵入性方法。
技术实现思路
本文提供了用于从粪便样品分离真核核酸的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：将所述样品与缓冲剂、表面活性剂和核糖核酸酶抑制剂混合以形成悬浮液；将所述悬浮液分离成富含真核细胞的部分和富含细菌细胞的部分，并且保留所述富含真核细胞的部分；向所述富含真核细胞的部分添加离液剂和任选地表面活性剂以形成裂解物；将所述裂解物分级成细胞碎片层，包含真核核酸的层，和脂质层；和收集所述包含真核核酸的层和任选地所述脂质层。所述粪便样品可以是人类或非人类动物粪便样品。在一些实施例中，所述非人类动物粪便样品可以是从狗或猫获得的样品。所述方法可以进一步包括从所述收集的包含真核核酸的层提取所述真核核酸。所述核酸可以包括DNA、RNA、总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或snoRNA，或任何DNA、RNA、总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或snoRNA的组合。还提供了用于检测粪便样品中的真核生物标志物的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：通过微阵列测序、分子条形码、探针捕获、聚合酶链反应(PCR)、ddPCR、RT-PCR、RT-qPCR或核酸测序分析所述提取的核酸。在一些实施例中，所述真核生物标志物选自图6(A组)或图13(B组)中列出的生物标志物。在一些实施例中，所述真核生物标志物可以是B细胞标志物、T细胞标志物或免疫球蛋白。还提供了用于确定受试者是否有结肠直肠癌风险的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：测量来自所述受试者的生物样品中的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因选自图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因中的任一种；比较所述样品中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所述测量的表达水平与对照中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平，其中所述生物样品中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者有结肠直肠癌风险。在一些实施例中，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因可以含于图5A中所示的200个差异表达的转录物簇内并且含于图5B中所示的与结肠直肠癌相关的共同途径内。在一些实施例中，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因可以选自图6(A组)或图13(B组)中列出的所述生物标志物。还提供了用于患有结肠直肠癌或有结肠直肠癌风险的受试者的临床计划的材料和方法。所述方法可以包括以下步骤：测量来自所述受试者的生物样品中的两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的表达水平，所述结肠直肠赘瘤生物标志物基因选自图6(A组)或图13(B组)中列出的结肠直肠赘瘤生物标志物基因中的任一种；比较所述样品中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所述测量的表达水平与对照中的所述两种或更多种结肠直肠赘瘤生物标志物基因的所测量表达水平，其中所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者患有结肠直肠癌或有结肠直肠癌风险；和基于以下选择临床计划：所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述两种或更多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者患有结肠直肠癌或有结肠直肠癌风险。还提供了用于确定非人类动物是否有胃肠病症风险的方法和组合物。所述方法可以包括以下步骤：测量来自所述受试者的生物样品中的一种或多种B细胞、T细胞或免疫球蛋白基因的表达水平；比较所述样品中的所述一种或多种B细胞、T细胞或免疫球蛋白基因的所述测量的表达水平与对照中的一种或多种B细胞、T细胞或免疫球蛋白基因的所测量表达水平，其中所述生物样品中的所述一种或多种基因的所述测量的表达水平相对于所述对照中的所述一种或多种基因的所述测量的表达水平的差异指示所述受试者有胃肠病症风险。所述胃肠病症可以是胃肠淋巴瘤或炎性肠病。所述非人类动物可以是猫或狗。所述生物样品可以是粪便样品。附图说明本专利技术的这些和其它特征和优势将在本专利技术的优选实施例的以下详细描述中更充分公开或显而易见，所述详细描述将与附图一起考虑，其中类似数字表示类似部分，并且此外其中：图1是电泳文件运行。电泳分析用于检查提取的RNA的品质。图2是电泳图。电泳图用于检查提取的RNA的品质。图3是提取概述。这描绘了使用实例2中描述的提取方法评估的120个样品的品质检查的概述。图4A是描绘比较总RNA提取方法的实验的结果的图。图4A展示了使用实例2中描述的提取方法通过品质检查的样品的总数目。图4B描绘了来自各种提取方法的五次电泳运行图5A是展示差异表达的转录物簇的热图。如所展示，使用200个转录物簇产生热图，所述转录物簇映射到187个不同基因，并且在训练集中分析265个样品。样品按组排序：癌症(红色)、癌前腺瘤(橙色)和正常(绿色)。图5B展示了使用GAGER-Package的差异表达的GO项和途径(p<0.05)。每个条的高度详述了每个途径内富集基因的集大小，并且蓝色线展示了每个途径的-log(p值)。红色虚线指示显著性(p＝0.05)。图6展示了鉴定为在结肠直肠赘瘤中差异表达的基因的列表。图7A描绘了电泳运行，展示4个个别猫样品和4个个别犬样品。图7B展示了4个个别猫样品和4个个别犬样品的RNA完整性数(RIN)和所有八个样品的平均值。图7C展示了4个个别猫样品和4个个别犬样品的从电泳运行估算的真核RNA浓度(ng/uL)和所有8个样品的平均质量。图8A描绘了用于鉴定犬样品中淋巴细胞相关转录物的存在的IgMCμ重链区的RT-qPCR结果。图8B描绘了犬样品中的T细胞受体γ区的两次重组的RT-qPCR结果。图9描绘了猫样品中的肌动蛋白-B的RT-qPCR结果。图10A描绘了使用昂飞(Affymetrix)人类转录物组阵列的70,524个转录物簇表达水平的4个技术重复。图10B描绘了使用昂飞人类转录物组阵列的70,524个转录物簇表达水平的4个生物重复。图10C描绘了使用昂飞人类转录物组阵列分析70,524个转录物簇表达水平的间隔6个月测试的6个技术重复。图11A描绘了使用昂飞人类本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从粪便样品分离真核核酸的方法，所述方法包含：a)将所述样品与缓冲剂、表面活性剂和核糖核酸酶抑制剂混合以形成悬浮液；b)将所述悬浮液分离成富含真核细胞的部分和富含细菌细胞的部分，并且保留所述富含真核细胞的部分；c)向所述富含真核细胞的部分添加离液剂和任选地表面活性剂以形成裂解物；d)将所述裂解物分级成细胞碎片层，包含真核核酸的层，和脂质层；和e)收集所述包含真核核酸的层和任选地所述脂质层。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.27 US 62/413,708;2017.06.22 US 62/523,511;1.一种从粪便样品分离真核核酸的方法，所述方法包含：a)将所述样品与缓冲剂、表面活性剂和核糖核酸酶抑制剂混合以形成悬浮液；b)将所述悬浮液分离成富含真核细胞的部分和富含细菌细胞的部分，并且保留所述富含真核细胞的部分；c)向所述富含真核细胞的部分添加离液剂和任选地表面活性剂以形成裂解物；d)将所述裂解物分级成细胞碎片层，包含真核核酸的层，和脂质层；和e)收集所述包含真核核酸的层和任选地所述脂质层。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含提供粪便样品。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述粪便样品是人类粪便样品。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述粪便样品是非人类动物粪便样品。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非人类动物选自由以下组成的群组：狗、猫、非人类灵长类动物、反刍动物、熊科动物、马科动物、猪、绵羊、山羊、骆驼、水牛、鹿、麋鹿、驼鹿、鼬科动物、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、厚皮动物、犀牛和灰鼠。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述非人类动物是狗。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述非人类动物是猫。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包含离心。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包含基于柱的方法。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤利用结合真核细胞的靶向探针。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤利用差异过滤。12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a和b重复一次、两次、三次、四次或更多次。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级步骤包含离心。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级步骤利用特异性结合真核核酸的靶向探针。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级步骤利用差异过滤。16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d和e重复两次或更多次。17.根据权利要求1所述的方法，其中使用小孔尖端收集所述包含真核核酸的层。18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含从所述收集的包含真核核酸的层提取所述真核核酸。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取方法是基于磁性颗粒、基于柱、基于过滤器、基于珠粒或基于有机溶剂的方法。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含DNA、RNA、总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或snoRNA，或任何DNA、RNA、总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、smRNA或snoRNA的组合。21.一种检测粪便样品中的真核生物标志物的方法，所述方法包含：通过微阵列测序、分子条形码、探针捕获、聚合酶链反应(PCR)、ddPCR、RT-PCR、RT-qPCR或核酸测序分析权利要求1的所述提取的核酸。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述真核生物标志物选自图6(A组)或图13(B组)中列出的生物标志物。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述真核生物标志物是B细胞标志物、T细胞标志物或免疫球蛋白。24.一种确定受试者是否有结肠直肠癌风险的方法，所述方法包含：a)测量来...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃丽卡·巴内尔，安德鲁·巴内尔，康一明，伊丽莎白·沃兹勒，
申请(专利权)人：基因复制有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US