一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法。该方法首先将海桑属植物叶片黑暗处理，匀浆，离心，过滤，得到的滤液即为海桑属植物叶绿体；然后在得到的叶绿体中加入裂解缓冲液充分裂解，将得到的裂解混合溶液先用酚抽提，再用酚‑氯仿抽提，离心，得到的沉淀进行溶解，RNase消化，即可得到所述海桑属植物的叶绿体DNA；所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为3.5％～4.5％。利用该方法成功提取分离获得了质量高、纯度高的海桑属植物的叶绿体DNA，对分析海桑属植物的进化关系，设计SSR引物对现存海桑属植物群体进行遗传多样性分析，以及分析外来海桑属植物在国内的扩张和演化情况等具有重要意义，具有广泛的推广应用前景。

A Method for Extracting Chloroplast DNA from Sonneratia

【技术实现步骤摘要】
一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法
本专利技术属于植物基因工程
更具体地，涉及一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法。
技术介绍
红树林生态系统处于海陆动态交界面、周期性遭到海水浸淹的潮间带环境，作为独特的海陆边缘生态系统，具有极高的生态、社会和经济价值，特别是在固岸护堤、发展近海渔业、维持生物多样性、调节小气候、净化环境、发展生态旅游以及维持海岸带生态平衡等方面表现的尤为突出，是目前全球海洋生物多样性保护和全球气候变化研究的重要内容。海桑属(Sonneratia)红树植物隶属海桑科(Sonneratiaceae)，是热带和亚热带海岸红树林中的重要类群，属于典型的印度-西太平洋群系植物(IWP)。海桑属植物凭借其生长速度快，适应能力强，改良土壤效应的特点，成为我国海洋生态文明修复系统的首选植物。在我国，海桑属植物包括海桑、拟海桑、无瓣海桑、海南海桑、卵叶海桑和杯萼海桑6种。海桑属植物的叶片为适应环境，相较于陆生植物表现出了较厚的角质层和贮水组织等旱生及抗盐结构，这些结构对植物的蒸腾作用和调节水分平衡具有重要意义，但同时也为叶绿体的提取带来了很大的难度。叶绿体是负责捕获能量的绿色光合作用细胞器，具有半自主性的遗传表达系统，能编码部分自身遗传信息。随着分子测序技术的发展，1986年，Shinozaki等首次获得烟草植物的叶绿体基因组完整序列，使得叶绿体数据库迅速得到补充。据NCBI数据库统计，截止2018年，已发表的叶绿体基因组达到911个。因叶绿体基因组结构、大小和基因种类比较保守，叶绿体基因组成为研究海桑属植物的系统进化发育的有效工具，且提取纯度高的海桑属植物的叶绿体DNA，是进行完整海桑属植物叶绿体基因组测序、序列分析的前提。目前，提取植物叶绿体DNA的方法有蔗糖密度梯度离心法、Percoll密度梯度离心法、高盐低pH法、Dnase处理法、CTAB法和SDS法等，主要步骤为：叶绿体分离提取，叶绿体纯化裂解和叶绿体DNA提取等。由于植物界物种的丰富多样性，尤其是次生代谢产物的存在，导致了不同植物种类的样品存在巨大差异，因此，目前没有任何一种叶绿体DNA提取方法可以适用于全部的植物类型。研究人员需要针对不同类型、不同特征的植物，开发适用该植物的叶绿体DNA提取方法。海桑属植物是我国红树植物类群中非常重要的一个群体，因此，开发适用于海桑属植物的叶绿体DNA提取方法，对我国的红树植物分子进化研究具有重要的意义。但是，目前还没有针对海桑属植物的叶绿体DNA的提取方法。因此，亟待开发一种可以快速、简单、高效且安全的提取出高质量、高纯度的海桑属植物的叶绿体DNA的方法，以为进一步开展海桑属植物叶绿体基因组结构、功能和分子生物学研究方面提供前提保证。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有海桑属植物的叶绿体DNA的提取方法的空白，提供一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法。本专利技术在秉承经济有效、耗时短的原则的基础上，应用改进的高盐低pH法，结合海桑属植物本身的生物学特性进行研究，成功提取分离得到了高产量、高纯度的海桑属植物的叶绿体DNA，能够为后续的基因组测序工作奠定生物学基础。本专利技术的目的是提供一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法，包括以下步骤：S1.将海桑属植物叶片黑暗处理，匀浆，离心，过滤，得到的滤液即为海桑属植物叶绿体；S2.在步骤S1得到的叶绿体中加入裂解缓冲液充分裂解，将得到的裂解混合溶液先用酚抽提，再用酚-氯仿抽提，离心，得到的沉淀进行溶解，RNase消化，即可得到所述海桑属植物的叶绿体DNA；其中，步骤S2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为3.5％～4.5％。由于海桑属植物具有红树植物的一般特征，可能与其适应海水浸泡的生物环境有关，具有肉质化、此生代谢物多等特征，这些特征导致了现有方法提取海桑叶绿体DNA时，均发现产率低，DNA纯度不足等问题。因此，本专利技术以高盐低pH法为基础，进行了重要的技术改进，从而获得了高产量、高纯度的海桑属植物的叶绿体DNA。本专利技术改进了叶绿体裂解混合溶液的离心条件，得到了最适合海桑属植物叶绿体的离心速度和时间；改进了裂解缓冲液中的十二烷基磺酸钠(SDS)的浓度，从而使得叶绿体获得了更好的裂解效果；叶绿体DNA提取过程中，增加了RNase消化，有效的避免了RNA污染，显著提高了海桑属植物的叶绿体DNA的纯度和质量。优选地，步骤S1所述离心的速度为100～300×g。当离心的速度过小(＜100×g)时，影响海桑属植物细胞器的分离质量，加大细胞核的污染；当离心的速度过大(＞300×g)时，影响海桑属植物细胞器的分离质量，加大线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子的污染。更优选地，步骤S1所述离心的速度为300×g。优选地，步骤S1所述离心的时间为1～5min。当离心的时间过短(＜1min)时，使得海桑属植物细胞器的分离不彻底；当离心的时间过长(＞5min)时，分离效率降低。更优选地，步骤S1所述离心的时间为3min。优选地，步骤S2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为3.8％～4.2％。当十二烷基硫酸钠的浓度＜3.5％时，叶绿体裂解不充分，DNA产量降低；当十二烷基硫酸钠的浓度＞4.5％时，盐分增加，对后续实验步骤有影响。更优选地，步骤S2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为4％。优选地，步骤S2所述RNase的浓度为100～500ng/uL。当RNase的浓度过小(＜100ng/uL)时，RNA降解的效率降低，容易产生RNA污染；当RNase的浓度过大(＞500ng/uL)时，成本增高，造成不必要的浪费。更优选地，步骤S2所述RNase的浓度为300ng/uL。优选地，步骤S2所述消化的时间为1～2h。当消化的时间＜1h时，会造成消化不完全，得到的DNA纯度不高；当消化时间＞2h时，效率降低。更优选地，步骤S2所述消化的时间为1.5h。优选地，步骤S2所述裂解混合溶液和所述酚的体积比为0.8～1.2：1。更优选地，步骤S2所述裂解混合溶液和所述酚的体积比为1：1。优选地，步骤S2所述裂解混合溶液和所述酚-氯仿的体积比为0.8～1.2：1。更优选地，步骤S2所述裂解混合溶液和所述酚-氯仿的体积比为1：1。所述酚的作用为：抽提叶绿体细胞DNA，使蛋白质变性，同时抑制DNase的降解。所述氯仿的作用为：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。另外，所述方法制备得到的海桑属植物的叶绿体DNA，也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法。本专利技术结合海桑属植物本身的生物学特性，制备得到了大量完整性好的海桑属植物叶绿体，并成功提取分离获得了质量高、纯度高的海桑属植物的叶绿体DNA；该方法经济有效、耗时短，有助于对海桑属植物这一重要的红树植物类群进行以叶绿体DNA序列为基础的分子进化研究，对分析海桑属植物的进化关系，设计SSR引物对现存海桑属植物群体进行遗传多样性分析，以及分析外来海桑属植物在国内的扩张和演化情况等具有重要意义，为海桑属植物的分子生物学研究奠定了基础。附图说明图1是海桑属植物叶绿体在不同离心条件下的荧光显本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将海桑属植物叶片黑暗处理，匀浆，离心，过滤，得到的滤液即为海桑属植物叶绿体；S2.在步骤S1得到的叶绿体中加入裂解缓冲液充分裂解，将得到的裂解混合溶液先用酚抽提，再用酚‑氯仿抽提，离心，得到的沉淀进行溶解，RNase消化，即可得到所述海桑属植物的叶绿体DNA；其中，步骤S2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为3.5％～4.5％。

【技术特征摘要】
1.一种海桑属植物的叶绿体DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将海桑属植物叶片黑暗处理，匀浆，离心，过滤，得到的滤液即为海桑属植物叶绿体；S2.在步骤S1得到的叶绿体中加入裂解缓冲液充分裂解，将得到的裂解混合溶液先用酚抽提，再用酚-氯仿抽提，离心，得到的沉淀进行溶解，RNase消化，即可得到所述海桑属植物的叶绿体DNA；其中，步骤S2所述裂解缓冲液中的十二烷基硫酸钠的浓度为3.5％～4.5％。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S1所述离心的速度为100～300×g。3.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，左欢欢，钟军弟，
申请(专利权)人：岭南师范学院，
类型：发明
国别省市：广东,44