一种针对土壤铁锰结核微生物的DNA提取试剂和提取方法技术

本发明专利技术公开了一种针对土壤铁锰结核微生物的DNA提取试剂和提取方法，该试剂包括清洗液、裂解液、洗涤液和洗脱液；清洗液含有Tris和EDTA，pH值为6～7；裂解液含有NaCl、Tris、柠檬酸钠、CaCl2和EDTA，pH值6～7；洗涤液含有NaCl和Tris，pH值6～7；洗脱液是灭菌双蒸水，pH值6～7。本发明专利技术提供的试剂和方法可成功提取稻田及甘蔗地来源铁锰结核DNA，提取出的DNA完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。对提取出的DNA可达到对16S rRNA等基因的PCR及测序要求。

A DNA Extraction Reagent and Method for Soil Ferromanganese Nodules

【技术实现步骤摘要】
一种针对土壤铁锰结核微生物的DNA提取试剂和提取方法
本专利技术属于基因组提取领域，具体涉及一种针对土壤铁锰结核微生物的DNA提取试剂和提取方法。
技术介绍
土壤铁锰结核是指表生过程中铁(Fe)和锰(Mn)元素经过强烈迁移和积聚形成的以铁锰元素为主的矿物集合体。土壤处于淹水条件时，铁锰氧化物被还原成Fe2+和Mn2+。而当土壤变干时，Fe2+、Mn2+又被氧化沉积在铁锰氧化物表面，干湿交替及氧化还原不断反复进行，最终形成铁锰结核。铁锰结核对土壤中化学反应的平衡有重要影响，对土壤中某些营养元素和污染元素的有效性和毒性有调节作用。土壤铁锰结核是土壤中重要的新生体，是在微生物作用下形成的一定时期的土壤产物。铁锰结核土壤中存在具有铁锰元素氧化还原活性的不同细菌类群，因而是研究土壤铁锰氧化细菌群落与多样性、并且是研究这些细菌在氧化铁、氧化锰矿物形成过程中所起作用的良好材料。因此，对土壤中铁锰结核内部环境中相关功能微生物的研究具有非常重要而深远的意义。相较于土壤复杂环境，铁锰结核内部高金属及厌氧条件下的微生物元素循环过程更接近于原始地球环境。铁锰结核被认为是研究厌氧环境金属元素循环过程的重要模式系统，其保存了最原始的参与Fe-Mn元素循环的微生物信息。全面地了解土壤铁锰结核中各种细菌(特别是与金属离子转化关系密切的微生物)丰度、种类组成及它们在金属元素转化中所起的作用，将有助于探讨土壤多金属结核成因的机理，为土壤发生过程中微生物群落的演变，及铁锰结核微生物成因提供一定的科学依据。目前针对锰结核中微生物的研究主要集中在结核内微生物的显微观察和富集培养等方面。然而可培养的微生物只占到自然界微生物总量的1％不到。需要全面了解铁锰结核相关微生物就需要利用基于现代分子生物学技术的非培养方法，此类方法需要提取到高质量的环境DNA。后续通过16SrRNA或其它标记基因的测序及定量方法，获得相关的物种组成及丰度信息，亦或是通过对相关特定功能基因进行测序及定量，获得关键过程的微生物物种及丰富信息。但是由于铁锰结核对PO43-，CO32-等阴离子有很强的吸附能力，对提取过程中所用溶液的离子浓度产生影响；另外铁锰结核表面或者内部都含有大量的金属离子，影响着DNA提取过程中各反应液的离子平衡；同时铁锰结核对带负电荷的核酸DNA也具有很强的吸附能力，对细胞破碎后释放的DNA回收产生了挑战。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一组针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取试剂，本申请从铁锰结核物质组成考虑，改组试剂可以降低高浓度铁锰氧化物及各种金属离子对细胞破裂、DNA回收的影响，从而获取高质量DNA用于后续的分子生物学实验。本专利技术的另一目的在于提供上述的试剂在土壤铁锰结核微生物DNA提取中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一组针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取试剂，包括清洗液(FPCB)、裂解液(FPLB)、洗涤液(FPWB)和洗脱液(FPEB)。所述的清洗液(FPCB)含有30～50mMTris和3～5mMEDTA(乙二胺四乙酸)，pH值为6～7；所述的裂解液(FPLB)含有50～100mMNaCl、100～200mMTris、10～20mM柠檬酸钠、20～50mMCaCl2和50～100mMEDTA，pH值6～7；所述的洗涤液(FPWB)含有100～150mMNaCl和5～10mMTris，pH值6～7；所述的洗脱液(FPEB)是灭菌双蒸水，pH值6～7；优选含有10～20mMTris。上述的一组试剂可用于土壤铁锰结核微生物DNA的提取，具体包括以下步骤：(1)野外采集含有土壤的铁锰结核，用灭菌超纯水冲洗其表面土壤，然后放入容器中，加入清洗液冲洗若干次，直至将附着在铁锰结核表面的土壤完全去除；这一步也在EDTA的作用下清除吸附于铁锰结核表面的金属离子；冰上保存运回实验室；(2)取经过清洗的铁锰结核，加入液氮，放置一段时间，使其脆化；然后研磨；(3)往研磨后的铁锰结核中加入直径为0.7mm和0.15mm的石榴石(两种粒径石榴石的结合可以提高对微生物细胞壁的破碎效率)，并加入裂解液，再次研磨；然后加入溶菌酶，35～37℃水浴0.5～1.0个小时；然后再加入蛋白酶K和SDS，37℃摇床震荡0.5～1.0个小时，后放入60～65℃水浴锅中水浴1～2个小时；步骤(3)中，铁锰结核与两种石榴石的重量比为1:(1-2):(1-2)；(4)水浴后的溶液放入细胞破碎仪中进一步裂解细胞，然后离心，取上清液；加入与上清液相同体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，上下颠倒混匀，并震荡几十秒，再次离心，取上清液；步骤(4)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心15～20分钟；步骤(4)所述的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿、异戊醇三者的体积比为25:24:1；(5)加入与上清液相同体积的无水乙醇，混匀后转移至硅胶膜离心柱；加入2倍上清液体积的洗涤液，抽吸滤过，该加入清洗液和抽吸滤过的操作重复若干次；(6)用乙醇溶液洗涤离心柱，然后将离心柱离心，甩干硅胶薄膜上的乙醇；往离心柱中加入预热的洗脱液，室温孵育几分钟，然后离心，沉淀即为水稻根表铁膜微生物的DNA；步骤(6)所述的乙醇溶液，其体积百分比为70～75％；步骤(6)所述离心的具体参数是，4～8℃，10000～12000转/分钟，离心2～10分钟；步骤(6)所述的预热，优选65℃预热。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：目前仍未有针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取方法，利用本专利技术提供的方法可成功提取稻田及甘蔗地来源铁锰结核DNA，提取出的DNA完整度高，电泳条带主要在15000bp以上。对提取出的DNA可达到对16SrRNA等基因的PCR及测序要求。附图说明图1是稻田土来源的铁锰结核实物图。图2是稻田铁锰结核微生物DNA琼脂糖凝胶电泳结果。图3是稻田铁锰结核微生物16SrRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。图4是稻田铁锰结核微生物组成。图5是甘蔗地来源的铁锰结核实物图。图6是甘蔗地铁锰结核微生物DNA琼脂糖凝胶电泳结果。图7是甘蔗地铁锰结核微生物16SrRNA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。图8是甘蔗地铁锰结核微生物组成。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1一种土壤铁锰结核DNA的提取试剂，包括清洗液FMCB、裂解液FMLB、洗涤液FMWB、洗脱液FMEB。清洗液FMCB制备：称取1.2gTris，3gEDTA，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为7.5，加入纯化水定容至1L。裂解液FMLB制备：称取11.7gNaCl，24.2gTris，0.6g柠檬酸钠，1.1gCaCl2，14.6gEDTA，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为8.0，加入去离子水定容至1L。洗涤液FMWB制备：称取9.84gNaCl粉末，并加入800ml去离子水，取10ml1MTris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为8.0，加入去离子水定容至1L。洗脱液FMEB：取10ml1MTris溶液至于容器中，并加入800ml去离子水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH值为8.0，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取试剂，其特征在于包括清洗液、裂解液、洗涤液和洗脱液；所述的清洗液含有30～50mM Tris和3～5mM EDTA，pH值为6～7；所述的裂解液含有50～100mM NaCl、100～200mM Tris、10～20mM柠檬酸钠、20～50mM CaCl2和50～100mM EDTA，pH值6～7；所述的洗涤液含有100～150mM NaCl和5～10mM Tris，pH值6～7；所述的洗脱液是灭菌双蒸水，pH值6～7。

【技术特征摘要】
1.一组针对土壤铁锰结核微生物DNA的提取试剂，其特征在于包括清洗液、裂解液、洗涤液和洗脱液；所述的清洗液含有30～50mMTris和3～5mMEDTA，pH值为6～7；所述的裂解液含有50～100mMNaCl、100～200mMTris、10～20mM柠檬酸钠、20～50mMCaCl2和50～100mMEDTA，pH值6～7；所述的洗涤液含有100～150mMNaCl和5～10mMTris，pH值6～7；所述的洗脱液是灭菌双蒸水，pH值6～7。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述的洗脱液含有10～20mMTris，pH值6～7。3.权利要求1或2所述的试剂在土壤铁锰结核微生物DNA提取中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括以下步骤：(1)野外采集含有土壤的铁锰结核，用灭菌超纯水冲洗其表面土壤，然后放入容器中，加入清洗液冲洗若干次，直至将附着在铁锰结核表面的土壤完全去除；冰上保存运回实验室；(2)取经过清洗的铁锰结核，加入液氮，放置一段时间，使其脆化；然后研磨；(3)往研磨后的铁锰结核中加入直径为0.7mm和0.15mm的石榴石，并加入裂解液，再次研磨；然后加入溶菌酶，35～37℃水浴0.5～1.0个小时；然后再加入蛋白酶K和SDS，37℃摇床震荡0.5～1.0个小时，后放入60～65℃水浴锅中水浴1～2个小时；(4...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，刘传平，李芳柏，
申请(专利权)人：广东省生态环境技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44