土星轮头酵母ZJPH1807及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种土星轮头酵母ZJPH1807及其应用，所述的应用为：以二酮类化合物(Ⅰ)为底物，以土星轮头酵母ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，加入助溶剂和辅助底物，于pH 6.0～8.0的缓冲液中构成转化体系，在25℃～50℃、150rpm～250rpm条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(13R,17S)‑乙基开环醇(Ⅱ)；本发明专利技术土星轮头酵母ZJPH1807制备所得产物的光学纯度高，e.e.值>99.9％。在pH 7.0的磷酸缓冲液体系中，加入7g/L的底物，反应12h，产物的产率为63.96％，时空产率为0.373g/L·h。

ZJPH1807 and its application

【技术实现步骤摘要】
土星轮头酵母ZJPH1807及其应用(一)
本专利技术涉及一种可用于二酮类化合物(Ⅰ)生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的新菌株—土星轮头酵母(Cyberlindnerasaturnus)ZJPH1807及其应用。(二)
技术介绍
(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)(化学名：2-乙基-3-羟基-2-[2-(6-甲氧基-3,4-二氢-1(2H)-萘亚基)乙基]环戊酮，分子式C20H24O3，CAS号：51773-49-0)是制备左炔诺孕酮的关键手性中间体。左炔诺孕酮(levonorgestrel，LNG)是目前应用广泛的第二代口服避孕药，主要作用于下丘脑和垂体，具有很好的孕激素活性和较强的与雄激素受体结合的能力，与雌激素合并使用，可用作短效和长效口服避孕药。它也可用于治疗月经不调，子宫功能性出血及子宫内膜异位症等。使用1.5mg的左炔诺孕酮就能紧急避孕，量小且服用次数少，胃肠反应轻微，对月经影响小，因此在妇科领域有着极其重要地位。A为底物二酮类化合物(Ⅰ)，B为产物(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)，C为左炔诺孕酮。目前左炔诺孕酮制备主要采用化学法。Ananchenko等(Anne-SophieChapelon,DelphineMoraleda,Rapha€elRodriguez,etal.Tetrahedron,2007,63(47):11511-11616.)采用硼氢化钠还原二酮类化合物(Ⅰ)制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)，反应后产生4种异构体。Wong等人(WongF.F.,ChuangS.H.,YangS.C.,etal.,Tetrahedron,2010,66(23):4068-4072.)利用一锅法合成工艺，以44.6mmol/L底物3-甲氧基-18-甲基雄甾-2,5-10-二烯-17-酮与Me3SiC≡CLi反应1h后，加入当量的四丁基氟化铵进行脱甲硅烷基，最终制得40.3mmol/L左炔诺孕酮，产率为90％。化学全合成法的工艺路线较复杂、反应条件较为苛刻、环境污染大。与化学法相比，微生物转化法具有更高的反应特异性，且符合“绿色化学”原则。近年来有研究者报道了利用生物法催化还原二酮类化合物(Ⅰ)制备左炔诺孕酮关键手性中间体(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)。Federica等人(Dall'OglioFederica,LetiziaContenteMartina,ContiPaola.CatalysisCommunications,2017,(93):29-32.)利用混合床反应体系进行不同酮类底物的还原，以KRED1-Pglu和BmGDH作为催化剂，加入3mmol/L二酮类化合物(Ⅰ)，反应6h后，(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)的产率为65％。Martina等人(LetiziaContenteMartina,MolinariFrancesco,SerraImmacolata.EuropeanJournalofOrganicChemistry,2016:1260-1263.)筛选了不同种类酵母菌作为催化剂进行生物还原，利用酿酒酵母(S.cerevisiae)CEN.PK113-7D催化时，加入10mmol/L的二酮类化合物(Ⅰ)，转化24h后产率达95％，对映体过量值(e.e.值)>98％。但采用P.glucozymaCBS5766和R.glutinisNRRL-Y1587为催化剂生物还原二酮类化合物(Ⅰ)，则生成了异构体(13S,17S)-乙基开环醇。利用微生物全细胞为催化剂，通过生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)，微生物酶源细胞可经发酵自行制备，质量稳定，成本低廉。并且在生物还原过程中，通过添加辅助底物可实现辅酶的原位再生。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种产羰基还原酶的微生物新菌株--土星轮头酵母(Cyberlindnerasaturnus)ZJPH1807，以及利用该菌株通过全细胞催化二酮类化合物(Ⅰ)生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)。与化学还原法相比，该方法的立体选择性高，催化剂制备成本低，且转化过程环境友好。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株--土星轮头酵母(Cyberlindnerasaturnus)ZJPH1807，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2019215，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。本专利技术还提供一种所述土星轮头酵母ZJPH1807在催化二酮类化合物(Ⅰ)生物还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)中的应用，所述的应用为：以二酮类化合物(Ⅰ)为底物，以土星轮头酵母ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，加入助溶剂和辅助底物，于pH6.0～8.0(优选pH7.0)的缓冲液中构成转化体系，在25℃～50℃(优选30℃)、150rpm～250rpm(优选200rpm)条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)；所述辅助底物为下列一种或两种：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘油、甲醇、乙醇、异丙醇、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸；所述助溶剂为下列之一：甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或丙酮。进一步，所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖和乳糖时，加入量以缓冲液体积计均为100g/L；所述辅助底物为甘油时加入量以缓冲液体积计为20～200g/L(优选140g/L)；所述辅助底物为甲醇、乙醇和异丙醇时，体积加入量以缓冲液体积计均为10-30％；所述辅助底物为L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸时，加入量以缓冲液体积计为5～25g/L(优选10g/L)；更优选所述辅助底物为甘油和L-酪氨酸的混合，其中甘油加入量以缓冲液体积计为20g/L～200g/L，优选140g/L，L-酪氨酸加入量以缓冲液体积计为5g/L～25g/L，优选10g/L。进一步，所述底物用量以缓冲液体积计为4.0～7.5g/L(优选4.5～7.5g/L，最优选7g/L)，湿菌体用量以缓冲液体积计为150～400g/L(优选250～400g/L，最优选350g/L)。进一步，所述缓冲液为下列之一：K2HPO4-KH2PO4缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和蒸馏水。优选地，所述反应以K2HPO4-KH2PO4缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4的一种构成缓冲液体系，最优选K2HPO4-KH2PO4(优选pH6～8，最优选pH7.0)。进一步，所述助溶剂体积加入量以缓冲液体积计为3～11％，最优选所述助溶剂为45℃热乙醇，体积添加量为5％。进一步，本专利技术所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将土星轮头酵母(Cyberlindnerasaturnus)ZJPH1807接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl0.75g/L，MgSO4·本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.土星轮头酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2019215，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。

【技术特征摘要】
1.土星轮头酵母(Cyberlindnerasaturnus)ZJPH1807，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2019215，保藏日期：2019年3月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。2.一种权利要求1所述土星轮头酵母ZJPH1807在催化二酮类化合物(Ⅰ)不对称还原制备(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)中的应用；3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：以二酮类化合物(Ⅰ)为底物，以土星轮头酵母ZJPH1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源，加入助溶剂和辅助底物，于pH6.0～8.0的缓冲液中构成转化体系，在25℃～50℃、150rpm～250rpm条件下进行转化，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(13R,17S)-乙基开环醇(Ⅱ)；所述辅助底物为下列一种或两种：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘油、甲醇、乙醇、异丙醇、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸；所述助溶剂为下列之一：甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或丙酮。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖和乳糖时，加入量以缓冲液体积计均为100g/L；所述辅助底物为甘油时加入量以缓冲液体积计为20-200g/L；所述辅助底物为甲醇、乙醇和异丙醇时，体积加入量以缓冲液体积计均为10-30％；所述辅助底物为L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸或L-丙氨酸时，加入量以缓冲液体积计为5-25g/L。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述辅助底物为甘油和L-酪氨酸的混合，其中甘油加入量以缓冲液体积计为140g/L，L-酪氨酸加入量以缓冲液体积计为10g/L。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物用量以缓冲液体积计为4.0～7.0g/L，湿菌体用量以缓冲液体积计为15...

【专利技术属性】
技术研发人员：王普，肖美娟，朱治任，夏娜娜，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33