人类MTHFR基因多态性检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用标记探针和特异性引物序列做基因多态性检测的方法及其包括特异性探针和特异性引物序列的试剂盒，适用于生物技术以及医学领域。试剂盒提供了用于同时检测人类MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性的特异性引物序列和标记探针，其中所述试剂盒含有Taq酶，特异性引物，特异性探针，内标系统。本发明专利技术所提供的引物和试剂盒用于同时检测MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。

Human MTHFR Gene Polymorphism Detection Kit

【技术实现步骤摘要】
人类MTHFR基因多态性检测试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及人类MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性检测试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
叶酸是一种水溶性的B族维生素(维生素B9)，它不存在于自然界中也无生物活性，但为具有生物活性的叶酸盐(folate)的前体，其在体内的活性形式是5-甲基四氢叶酸，能传递一碳基团(甲基或甲酰)给脱氧尿苷酸，使之变为脱氧胸苷酸，进而合成DNA，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素，有助于预防神经管缺陷，包括脊柱裂和无脑儿等非常严重的出生缺陷的发生。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低体重、唇腭裂、心脏缺陷等发病率。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolateredμctase,MTHFR)是细胞内叶酸平衡和代谢的关键酶，在嘌呤和胸腺嘧啶存在的条件下不可逆催化5-甲酸基四氢叶酸合成5-甲基四氢叶酸，后者参与DNA的合成与甲基化作用。MTHFR基因常见的突变有两种：677位点C/T多态性与1298位点A/C多态性。其中，C677T位点是到目前为止发现的MTHFR最为常见的突变位点，在中国的发生率为45.2％。研究表明，677位点由C突变为T后，其编码的丙氨酸被缬氨酸替代，导致MTHFR酶的热稳定性与酶活性降低，进而会使同型半胱氨酸(Hcy)代谢受阻，在体内积聚引起高同型半管氨酸血症。高同型半管氨酸血症与多发性流产、子痫前期、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死胎有关，且与早产密切相关。另外，1298位点A变为C后，谷氨酸被丙氨酸取代，同样使MTHFR的酶活性下降，引起血浆同型半胱氨酸水平的升高和叶酸水平的降低，该位点在中国突变的频率高达18.6％。在使用甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶的活性时，如果患者存在该变异，将造成严重的毒副反应。因此MTHFR基因多态性的检测对于个体化合理用药具有重要的指导意义。目前对基因突变和基因多态性的检测，常见的有高分辨熔解曲线分析技术(HRM法)、直接测序法、DNA芯片技术、PCR-RFLP法、Taqman探针法等。由于高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其费用较低，但操作耗时长且灵敏度低，难以实现大规模推广。DNA芯片技术由于高通量、操作简便快速等优点在SNP检测中得到大量应用，但该技术成本昂贵、复杂、重复性差、灵敏度低，不利于大规模推广。荧光定量PCR-Taqman探针法采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计特异性的探针灵敏度高、准确性强，2-3个小时内即可得出结果，因此得到大规模运用和推广。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，克服现有技术的不足，提供单管反应同时检测人类MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性的试剂盒，从对样本核酸的提取到给出检测结果，只需要2～3小时，同时还具有结果判读简单，检测通量大，检测成本低的优点。因此可在一般的分子实验室和医院检验科完成相应的检测；在临床检验进行使用，可大大增加临床诊断的准确性，缩短患者就医的时间，也可医疗保健系统成本降低。本专利技术的一种基于Taqman探针法的单核苷酸多态性检测方法，包括：(1)在同一PCR扩增体系中，设计两对低退火温度的富集引物，能通过PCR对分别包含677和1298两个SNPs位点目标靶模板进行扩增，其退火温度为45～55℃，所述富集引物的核苷酸序列如SEQIDNo.14和SEQIDNO:15所示；(2)在同一PCR扩增体系中，设计2组特异性引物序列，利用这两组特异性引物，进行对677和1298两个SNPs位点基因型进行位点特异性区分的AS-PCR扩增；特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1-6所示；(3)在同一PCR扩增体系中，设计2组SNP特异性探针来特异性检测目的模板，所述2组特异性探针的核苷酸序列分别为SEQIDNO:7与SEQIDNO:8，SEQIDNO:9与SEQIDNO:10，且所述特异性探针的5’端修饰分别为FAM与HEX，Cy3与Cy5，3’端修饰有NFQ-MGB；(4)在同一PCR扩增体系中，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。(5)优选的，本专利技术引入的内标系统为保守的GAPDH基因，设计的内标探针5’端修饰为ROX，3’端修饰有NFQ-MGB。本专利技术人类MTHFR基因多态性检测试剂盒涉及到的序列表如下：SEQIDNO:15’-TCTGCGGGAGCCGATTTCA-3’SEQIDNO:25’-TCTGCGGGAGTCGATTTCA-3’SEQIDNO:35’-CAAAGCGGAAGAATGTGTCA-3’SEQIDNO:45’-AGCTGACCAGTGAAGAAAGTGT-3’SEQIDNO:55’-AGCTGACCAGTGAAGCAAGTGT-3’SEQIDNO:65’-GAACCAGGGTCCCCACTCCAG-3’SEQIDNO:75’-FAM-TGCGGGAGCCGATTTCA-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:85’-HEX-TGCGGGAGTCGATTTCA-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:95’-Cy3-CAGTGAAGAAAGTGTCTTTGA-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:105’-Cy5-CAGTGAAGCAAGTGTCTTTGA-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:115’-CATCGCTCAGACACCATGG-3’SEQIDNO:125’-GCAAGGCTCGTAGACGCGGTTC-3’SEQIDNO:135’-ROX-TCGGAGTCAACGGGTGAGTT-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:145’-CAGCCTCTCCTGACTGTCATC-3’SEQIDNO:155’-GAGCAAGTCCCCCAAGGAG-3’本专利技术基于Taqman探针法，采用ARMS引物特异性扩增目的模板与SNP探针特异性检测目的模板方法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，其中UNG(μracil-N-glycosylase)酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染，为特异性检测同一基因两种多态性提供双重保证。附图说明图1为677C/C1298A/A纯合野生样本；图2为677C/C1298A/C杂合突变样本；图3为677C/T1298A/C杂合突变样本；图4为677C/T1298A/A杂合突变样本；图5为677T/T1298A/A纯合突变样本；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于同时检测人类MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性的试剂盒，其特征在于设有盒体、内衬、PCR混合液管、酶混合液管、阳性对照管和阴性对照管，内衬设在盒体内，PCR混合液管、酶混合液管、阳性对照管和阴性对照管分别插入内衬的孔内；PCR混合液管内装有PCR混合液，酶混合液管内装有酶混合液，阳性对照管内装有阳性标准对照品，阴性对照管内装有阴性标准对照品。

【技术特征摘要】
1.用于同时检测人类MTHFR基因C677T位点和A1298C位点多态性的试剂盒，其特征在于设有盒体、内衬、PCR混合液管、酶混合液管、阳性对照管和阴性对照管，内衬设在盒体内，PCR混合液管、酶混合液管、阳性对照管和阴性对照管分别插入内衬的孔内；PCR混合液管内装有PCR混合液，酶混合液管内装有酶混合液，阳性对照管内装有阳性标准对照品，阴性对照管内装有阴性标准对照品。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包含1×PCR反应液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP各0.2mM，各条探针0.2μM，各条引物0.4μM；所述酶混合液包括5μ/μLTaqDNA聚合酶、0.1μ/μLμNG酶。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有2组特异性引物序列，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1-6所示。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有2组特异性探针，所述2组特异性探针的核苷酸序列分别为SEQIDNO:7与SEQIDNO:8，SEQIDNO:9与SEQIDNO:10，且所述特异性探针的5’端修饰分别为FAM与HEX，Cy3与Cy5，3’端修饰有NFQ-MGB。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内标系统，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示，所述内标探针的核苷酸序列如SEQIDNO:13所示。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏赵延，李思慧，徐倩，曹丹枫，
申请(专利权)人：江苏正大天创生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32