生产单萜的方法技术

本发明专利技术涉及一种生产单萜和/或其衍生物的方法。该方法包括以下步骤：a)提供经基因工程修饰以表达细菌的单萜合成酶(mTS)的宿主微生物；和b)使香叶基焦磷酸(GPP)与该细菌的mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。本发明专利技术还涉及一种用于生产单萜和/或其衍生物的微生物，以及一种重组微生物，所述重组微生物适于通过表达细菌的mTS以进行将香叶基焦磷酸(GPP)转化为单萜和/或其衍生物的步骤。它显示使用1,8桉叶素合成酶产生1,8桉叶素，以及使用芳樟醇合成酶生产芳樟醇，所述1,8桉叶素合成酶和芳樟醇合成酶均来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。

Production of monoterpenes

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产单萜的方法
本专利技术涉及一种生产单萜的方法。特别地，本专利技术涉及一种例如在宿主微生物中通过细菌的单萜合成酶的作用生产单萜的方法。
技术介绍
萜类化合物(也称为类异戊二烯)是最丰富和最大类别(>75000)的天然产品。在植物中最常见，它们的生物学作用多种多样，从物种间的信息传递到细胞内的信号传导，以及对捕食性物种的防御。它们具有广泛的应用范围，用于制药、除草剂、调味剂、香料和生物燃料中。由于萜类化合物的广泛商业利益，近年来通过合成的生物学途径合成萜类化合物的步伐日益加快。萜类化合物的底物由C5异戊二烯结构单元，即二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯焦磷酸(IPP)合成。DMAPP和IPP的组合可以产生不同碳长度的底物，然后可以被萜类合成酶(Terpenesynthase)/环化酶用于生产单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)等。例如，通过偶联DMAPP和IPP的各一个分子来合成用于制备所有单萜的底物的香叶基焦磷酸(GPP)。单萜合成酶(Monoterpenesynthase，mTS)是使用单个C10底物分子香叶基焦磷酸(GPP)产生数千种不同单萜的酶。植物mTS的结构具有两个结构域结构：一个I类萜类化合物折叠C-30末端结构域和一个功能未知的相对小的N-末端结构域。活性位点的氨基酸序列变化以及GPP识别的保守残基导致mTS在生物学中进行一些最复杂的反应，形成了线性萜类化合物、单环萜类化合物和双环萜类化合物。近年来，通过使用酵母或大肠杆菌作为宿主并使用植物来源的mTS，已经在经工程改造的微生物中产生了许多单萜烃类化合物。然而，得到的单萜产量相对较低。在此类体系中产生的单萜类化合物的实例包括香叶醇、β-月桂烯、柠檬烯和松萜。大肠杆菌是全世界学术界和工业界的重组蛋白生产的主力军。这种偏爱的选择是由于其易于将外部DNA材料引入细胞、快速的生长周期和使用廉价的生长培养基。如上所述，为了使用合成的生物学途径生产单萜，已经使用了植物mTS。然而，这种植物mTS的使用具有相关的缺点。本专利技术人的实验表明，当在大肠杆菌中过表达时，许多植物mTS会产生大部分不溶性蛋白质，即不适合单萜的生物合成的非活性物质。已证明这种有限的溶解度是生产单萜的瓶颈，因为宿主细胞中的大多数GPP分子都没有用于合成单萜，导致了产品产量/滴度低。对于被广泛用作清洁剂中香料的芳樟醇的生物合成尤其如此。当在酵母或大肠杆菌中时，使用植物芳樟醇合成酶导致非常低的产物滴度(0.1-1mg/Lorg-1)。由内源性大肠杆菌活性引起的类香叶醇(geranoid)副产物(>10倍过量)的存在表明这些观察到的滴度低与底物有效性无关。缺乏稳健性也使得植物mTS成为蛋白质工程改造的靶标的吸引力降低。此外，植物来源的mTS酶通常显示出高度的产物多样性，导致产物为混合物而非纯净产物的特征。对于更复杂的双环单萜支架如用于调味剂、香料和化妆品的1,8-桉叶素(也称为桉树脑)而言尤其如此。使用几种不同植物来源的桉叶素合成酶均得到了相对的1,8-桉叶素的量为42-64％(Leferink,N.G.H.etal.A‘PlugandPlay'PlatformfortheProductionofDiverseMonoterpeneHydrocarbonScaffoldsinEscherichiacoli.(2016))。需要生成单一的、纯净的产物，从而需要较少的下游处理。本专利技术的一个目的是消除或减轻一个或多个上述问题。专利技术概述本专利技术涉及一种生产单萜和/或其衍生物的方法。本专利技术还涉及用于生产单萜和/或其衍生物的微生物和适于生产单萜的重组微生物。本专利技术某种程度上基于专利技术人的研究，其中它们显示在大肠杆菌中某些细菌单萜合成酶的表达(mTS)会导致高产量且高纯度的单萜。生产单萜和/或其衍生物的方法包括以下步骤：提供经基因修饰以表达细菌单萜合成酶(mTS)的宿主微生物，和使香叶基焦磷酸与所述细菌mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。在本专利技术的第一方面，提供了一种在宿主微生物中生产单萜和/或其衍生物的方法，其包括以下步骤：(a)提供经基因修饰以表达细菌单萜合成酶(mTS)的宿主微生物；和(b)使香叶基焦磷酸(GPP)与所述细菌mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。在本专利技术人进行的研究中，它们出人意料地显示：当使用细菌单萜合成酶时，可以在宿主微生物中产生高产量且高纯度的单萜烯。如下述更详细的讨论，使用细菌mTS时获得的产量和纯度出人意料地高于使用植物来源的mTS时的产量和纯度。单萜和/或其衍生物本专利技术的方法包括使香叶基焦磷酸(GPP)与所述细菌mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。如本领域技术人员所理解的，术语单萜和/或其衍生物用于定义与“起始材料”香叶基焦磷酸不同的“产物”单萜。如上所述，萜类例如单萜类具有多种应用，包括药物、除草剂、调味剂、香料和生物燃料。在本专利技术第一方面的方法中生产的单萜可以是任何合适的单萜或其衍生物。本专利技术的单萜的合适衍生物可以通过例如烷基化、氧化或还原来获得。例如，单萜衍生物可包括单萜类化合物。如本领域技术人员所理解的，可以通过独立于mTS的单萜的化学衍生化来生产单萜衍生物。或者，可以通过宿主微生物中存在的mTS本身或另一种酶生物学生产单萜衍生物。在本专利技术第一方面的方法中生产的单萜或其衍生物可以是例如香叶醇、罗勒烯、柠檬醛、香茅醛、香茅醇、芳樟醇、海乐萌(halomon)、柠檬烯、蒎烯、蒈烯、桧烯、莰烯、崖柏烯、樟脑、冰片、阿米替林(terpioline)、萜品烯、水芹烯、萜品醇、葑醇、1,8-桉叶素或β-月桂烯。在本专利技术的实施方案中，单萜可以是芳樟醇或1,8-桉叶素和/或其衍生物。宿主微生物本专利技术的宿主微生物可以是非天然存在的微生物，例如基因修饰的细菌、古细菌、酵母、真菌、藻类或任何各种其他微生物。在本专利技术实施例中，宿主微生物是细菌。适宜细菌的实例包括属于埃希氏菌属变形杆菌的肠杆菌(Escherichia)、产气肠杆菌(Enterobacter)、泛生菌(Pantoea)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、沙雷氏菌(Serratia)、欧文氏菌(Erwinia)、沙门氏菌(Salmonella)或摩根氏菌(Morganella)，属于短杆菌属的棒状杆菌(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或微杆菌属(Microbacterium)、和属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、甲烷球菌属(Methane-coccus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、轴根瘤菌属(Axorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、无浆体属(Anaplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、巴尔通体属(Bartonella)、鲍特氏菌(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布氏杆菌属(Brucella)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、鞘杆菌属(Calymmatobacte本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在宿主微生物中生产单萜和/或其衍生物的方法，其包括以下步骤：(a)提供经基因修饰以表达细菌的单萜合成酶(mTS)的宿主微生物；和(b)使香叶基焦磷酸(GPP)与所述细菌的mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.31 GB 1701548.81.一种在宿主微生物中生产单萜和/或其衍生物的方法，其包括以下步骤：(a)提供经基因修饰以表达细菌的单萜合成酶(mTS)的宿主微生物；和(b)使香叶基焦磷酸(GPP)与所述细菌的mTS接触以产生所述单萜和/或其衍生物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主微生物包含E.coli。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细菌的mTS包含链霉菌(Streptomyces)的mTS。4.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述细菌的mTS包含棒状链霉菌(Streptomyucesclavuligeru...

【专利技术属性】
技术研发人员：维贾伊库马尔·卡鲁皮亚，妮科尔·G·H·莱费林克，尼格尔·S·斯克鲁顿，
申请(专利权)人：C三生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB