烃的生产制造技术

本发明专利技术公开了一种脂肪酸脱羧酶，所述脂肪酸脱羧酶包含与SEQ ID NO:1或2具有至少40％的序列同一性的序列，并且在对应于SEQ ID NO:1的G462位具有氨基酸取代。1的G462位具有氨基酸取代。1的G462位具有氨基酸取代。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】烃的生产
[0001]本申请要求于2018年4月20日提交的英国专利申请1806483.2的优先权，本申请通过引用上述英国专利申请的全文并入本专利技术。


[0002]本专利技术涉及烃的酶促生产方法以及适用于所述方法的酶、构建体和细胞。具体地，本专利技术涉及从生物质原料酶促生产轻链烷烃，例如丁烷、丙烷和异丁烷的材料和方法。

技术介绍

[0003]对经济上可行的微生物生物燃料的深入研究反映了全球对减少碳排放、减少化石燃料供应的担忧，以及开发可再生和可持续的替代性能源战略的必要性[1,2]。对能源安全和气候变化的担忧，推动了限制温室气体的排放、加大废弃生物材料回收利用的政府决策，并驱动以生态为基础的经济发展[3,4]。这促进了最近对利用多种微生物宿主进行的生物燃料生产(如生物酒精)的广泛研究[5]。
[0004]当前交通业的化石燃料(例如无铅汽油)包含30多种脂肪族和芳族烃类，主要是戊烷、丙烷和壬烷[6]。化石燃料的燃烧是一种主要的污染源，其导致温室气体排放、酸雨和气候变化。相比而言，丙烷是一种高效、清洁的燃料，碳排放量低；与原油相比，其一氧化碳和烃的排放量显著减少。丙烷是液化石油气(LPG)的主要成分，来源于天然气或石油精炼[7]。它是全球第三大广泛使用的交通燃料(每年2000万吨)，也是家庭供热、能源和环境友好型制冷剂和气溶胶推进剂的常见来源[7,8]。它与其他替代性气体燃料相比具有优势，因为其易于与碳氢化合污染物分离，并且液化和存储所需的能源较低[8]。
[0005]由于缺乏天然可以代谢产生丙烷的已知微生物，丙烷的生物制备途径受到限制。然而，从海洋原绿球藻(Procholorococcus marinus)st.MIT9313中发现的蓝藻脂肪醛去甲酰加氧酶(cyanobacterial aldehyde deformylating enzyme,ADO)展现出了微生物制备烃的可能性[9]。该酶催化铁氧还蛋白和主要长链脂肪醛的氧依赖性脱羰基化，生成烷烃和甲酸盐(图1A)[9]。利用基于结构的对ADO底物接入通道的工程改造，产生了具备丙烷生产能力增强的A134F变体[10]。现有技术公开了使用ADO在大肠杆菌中生产微生物来源丙烷的合成生物学途径，其中，通过脂肪酸生物合成[11]、反向β-氧化[6]、缬氨酸生物合成(异丁醛前体)[7]或梭菌丁醇通路[8]制备前体丁醛。然而，上述方法都存在ADO转换率极低的瓶颈(约3-5h-1
)，据报道，庚烷的k
cat
值仅为～1min-1
[12]。因此，其报道的微生物来源的生物丙烷产量最多仅32mg/L[6,8,11]。需要对ADO催化丁醛的速率进行相当大的改进，以使得生物丙烷的制备途径具有商业可行性。
[0006]最近描述了一种新型的光能酶，其催化游离脂肪酸的蓝光依赖性脱羧生成正构烷烃或烯烃[13]。来自变异小球藻(Chlorella variabilis)NC64A的这种脂肪酸光脱羧酶或光烷烃合成酶(PAS或FAP)是葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族的成员，并包含结合的光激发FAD辅因子，其量子产率>80％(0.86
±
0.13s-1
)[13]。这一发现开辟了生物催化生产烃类燃料的新领域，因其避免使用了催化缓慢的ADO酶。虽然长链脂肪酸是PAS的优选底物，但通
过工程改造该酶以提高其催化丁酸的性能可提供新的丙烷生物合成途径。
[0007]本文记载了丙烷的体内生物生产工艺，该工艺使用了变异小球藻(C.variabilis)的脂肪酸脱羧酶(CvPAS或CvFAP)。我们对底物接入通道进行定点突变，得到了突变型G462V(G402V成熟序列)，其对丁酸的催化性能有所提高。本专利技术研究是在嗜盐单胞菌(Halomonas)菌株中进行的，该菌株是已知的稳定低成本生产聚羟基脂肪酸酯生物塑料的宿主[14,15]。这种生物能够在高pH和高盐浓度的非无菌环境中生长，而没有明显的微生物污染[14]。据我们所知，这是首次报道将嗜盐单胞菌用作气态生物燃料生产宿主的例子，并且将其与增强型的生产丙烷的CvPAS变体相结合是实现商业可行化生物丙烷生产的关键进展。
专利技术概要
[0008]本专利技术公开的第一方面是一种脂肪酸脱羧酶，所述脂肪酸脱羧酶包括与SEQ ID NO:1或2的参照序列具有至少40％的序列同一性的序列，并且在对应于SEQ ID NO:1的G462位具有氨基酸取代。
[0009]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含选自G462V、G462F、G462I、G462L、G462A、G462Y、G462C、G462H、G462N、G462Q和G462W的氨基酸取代。任选地，所述取代是G462V或G462I。
[0010]在本文公开的一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶还包含至少一种个对应于以下位点上的氨基酸取代：SEQ ID NO：1的V453、SEQ ID NO：1的G455、SEQ ID NO：1的A457、SEQ ID NO：1的Y466或SEQ ID NO：1的T484。
[0011]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含选自V453F、V453I、V453L、V453W、V453E和V453A的氨基酸取代。所述取代可以优选为V453F、V453I、V453L和V453W中的一个。任选地，所述取代可以为V453I。
[0012]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含选自G455F、G455I、G455V、G455W、G455L、G455E和G455A的氨基酸取代。所述取代可以优选为G455F、G455I、G455V、G455W和G455L中的一个。
[0013]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含选自A457F、A457I、A457L、A457V、A457W和A457E的氨基酸取代。所述取代可以优选为A457F、A457I、A457L和457V中的一个。
[0014]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含选自Y466W、Y466F、Y466I、Y466V、Y466L、Y466E和Y466A的氨基酸取代。所述取代可以优选为Y466W。
[0015]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：T484A、T484E、T484I、T484L、T484F、T484V和T484W。所述取代可以优选为T484A、T484E、T484I和T484L中的一个。
[0016]在一实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含氨基酸取代G462V和V453I。
[0017]在一实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含氨基酸取代G462I和V453I。
[0018]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含与SEQ ID NO:1的425-429位残基共有的氨基酸序列，其中所述共有序列包含与SEQ ID NO:3具有至少70％的序列同一性的序列。
[0019]在一些实施方案中，所述脂肪酸脱羧酶包含在对应于SEQ ID NO：1的398-57本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶包括与SEQ ID NO:1或2具有至少40％的序列同一性的序列，并且在对应于SEQ ID NO:1的G462位具有氨基酸取代。2.如权利要求1的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述氨基酸取代选自G462V、G462F、G462I、G462L、G462A、G462Y、G462C、G462H、G462N、G462Q和G462W。3.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶包含与SEQ ID NO:1的第425-429位残基具有共有序列的氨基酸序列，其中所述共有序列包含与SEQ ID NO:3具有至少70％的序列同一性的序列。4.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶包含在对应于SEQ ID NO：1的398-575位残基具有活性位点的氨基酸序列，所述活性位点与选自SEQ ID NO：4-7的一个或多个序列具有至少70％的同一性。5.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶包含与SEQ ID NO：1或2具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。6.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶的底物为链长等于或小于8个碳的脂肪酸，优选链长为2-5个碳的脂肪酸。7.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述氨基酸取代在空间上阻碍所述脂肪酸脱羧酶结合链长大于8个碳的脂肪酸。8.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，与在SEQ ID NO：1的G462位无取代的脂肪酸脱羧酶相比，所述脂肪酸脱羧酶在以C
n+1
脂肪酸作为底物并生成相同的C
n
烷烃时可以获得更高的产量，其中n≤5。9.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶与包含SEQ ID NO：1的野生型脂肪酸脱羧酶相比，具有更高的丁酸至丙烷的脱羧酶产率。10.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶具有光依赖性脱羧酶活性，例如蓝光依赖性脱羧酶活性，优选所述活性依赖于波长为400-520nm的光。11.如前述任一项权利要求所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶还包含至少一种对应于以下位点上的氨基酸取代：SEQ ID NO：1的V453、SEQ ID NO：1的G455、SEQ ID NO：1的A457、SEQ ID NO：1的Y466或SEQ ID NO：1的T484。12.如权利要求11所述的脂肪酸脱羧酶，其特征在于，所述脂肪酸脱羧酶包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：V453F、V453I、V453L、V453W、G455F、...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：C三生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：