一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用。本发明专利技术中的硫酸软骨素裂解酶enCSase，分离自发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术中的硫酸软骨素裂解酶enCSase是一种新型CSase ABC酶，对硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸均有较高的酶活性，降解硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸时为内切酶模式；可应用于硫酸软骨素寡糖、硫酸皮肤素寡糖和透明质酸寡糖的制备，在医药及食品等领域具有广阔的应用前景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，涉及一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)是由β-D-葡萄糖醛酸(GlcUA)或α-L-艾杜糖酸(IdoUA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)组成的二糖单元重复连接而成的线性阴离子多糖。在动物组织中，通常作为蛋白聚糖的侧链在细胞表面以及细胞外基质中广泛分布。作为重要的一类糖胺聚糖，CS/DS涉及各种生理和病理过程，例如细胞粘附，细胞分化，细胞迁移，细胞增殖，伤口修复，神经系统发育，信号传导和免疫反应。在生物合成过程中，组成CS/DS糖链的基本二糖单元GlcUAβ1-3GalNAc(O unit)经常会发生各种生物合成修饰，从而导致CS/DS糖链具有很大的结构异质性，同时赋予其丰富的生物学功能。在特定的磺基转移酶的作用下，GlcUA/IdoUA残基的C2位置和GalNAc残基的C4和/或C6位置被硫酸化以形成各种特征性二糖单元，例如GlcUAβ1-3GalNAc(4-O-sulfate)(A unit)，GlcUAβ1-3GalNAc(6-O-sulfate)(C unit)，GlcUA(2-O-sulfate)β1-3GalNAc(6-O-sulfate)(D unit)，GlcUAβ1-3GalNAc(4,6-O-disulfate))(E unit)和GlcUA(2-O-sulfate)β1-3GalNAc(4,6-O-disulfate)(T unit)，这是CS链多样性的根本原因。而且，在DS链中，基本的重复二糖单元是IdoUAβ1-3GalNAc，是CS链中的GlcUA残基通过C5差向异构酶的作用向IdoUA残基的差向异构化而形成，通常导致CS和DS以杂合体的形式存在。但是，结构的复杂性极大地限制了CS/DS的结构和功能研究。
[0003]细菌来源的CS/DS裂解酶通过β-消除反应降解CS/DS，断开己糖胺和糖醛酸残基之间的1
→
4糖苷键，从而在非还原端形成4,5-不饱和双键，是研究CS/DS的结构和功能过程中必不可少的工具。通常，CS/DS裂解酶根据其底物特异性分为四类：CSase ABC，它降解CS和DS以及透明质酸(HA)；CSase AC，选择性催化CS和HA；CSase B，仅特异性切割DS；CSase C，倾向于降解CS/DS链中富含C单元的结构域。在这些CS/DS裂解酶中，CSase ABC由于其底物范围广，因此在CS/DS的结构和功能分析和生物活性寡糖制备以及某些疾病的治疗过程中具有重要应用，例如脊髓损伤，周围神经损伤，中风，冠状动脉再灌注，腰椎间盘突出症，帕金森氏病和某些类型的癌症。但是，迄今为止仅极少数的CSase ABC被人鉴定及报道。其中，最为广泛使用的商品化CSase ABC是寻常变形杆菌的发酵产物，它是两种酶的混合物：CSase ABC-I和CSase ABC-II。然而，很难通过纯化和重组表达来制备其高纯度和活性形式。因此，对于基础研究和应用都迫切需要鉴定具有更好的酶学特性的新型CSase ABC。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的不足，本专利技术提供了一种硫酸软骨素裂解酶enCSase及其编码基因与应用，该酶具有高效的降解硫酸软骨素的酶活性。
[0005]本专利技术的技术方案是：
[0006]一种硫酸软骨素裂解酶enCSase，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]根据本专利技术优选的，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase为内切酶，分离自发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。
[0008]本专利技术的硫酸软骨素裂解酶enCSase降解硫酸软骨素或硫酸皮肤素多糖时，终产物为不饱和四糖和不饱和二糖，降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素的最小寡糖单位为六糖；重组硫酸软骨素裂解酶enCSase降解透明质酸时，终产物为不饱和六糖和不饱和四糖，降解透明质酸的最小寡糖单位为八糖。
[0009]上述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]根据本专利技术优选的，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因来源于发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。
[0011]一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因。
[0012]根据本专利技术优选的，所述表达载体为大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。
[0013]一种重组细胞，在宿主细胞中插入了上述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因。
[0014]根据本专利技术优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
[0015]进一步优选的，所述的大肠杆菌宿主细胞为Escherichia coli BL2 1、Escherichia coli JM 109或Escherichia coli DH 5α；所述酵母菌宿主细胞为Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris或Kluyveromyces Iactis；所述枯草杆菌宿主细胞为Bacillus subtilis R25或Bacillus subtilis 9920；所述乳酸菌宿主细胞为Lactic acid bacteria C0CC101；所述放线菌宿主细胞为Streptomyces spp.；所述丝状真菌宿主细胞为Trichoderma viride，Trichoderma reesei，Aspergillus niger或Aspergillus nidulans；所述昆虫细胞为Bombyxmori或Antharaea eucalypti；所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL。
[0016]上述重组细胞在重组表达硫酸软骨素裂解酶enCSase中的应用。
[0017]上述硫酸软骨素裂解酶enCSase在制备硫酸软骨素寡糖，硫酸皮肤素寡糖和/或透明质酸寡糖中的应用。
[0018]上述硫酸软骨素裂解酶enCSase在研究CS/DS结构与功能中的应用。
[0019]有益效果：
[0020]1、本专利技术中的硫酸软骨素裂解酶enC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硫酸软骨素裂解酶enCSase，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase，其特征在于，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase为内切酶，分离自发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。3.权利要求1所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因来源于发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，发光杆菌QA16于2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。5.一种重组表达载体，其特征在于，在表达载体中插入了权利要求3所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因。6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。7.一种重组细胞，其特征在于，在宿主细胞中插入了权利要求3所述的硫酸软骨素裂解酶enCSase的编码基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：李福川，张庆冬，路丹荣，魏琳，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：