一种倍半萜合酶IlTPS1，编码核苷酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种倍半萜合酶IlTPS1，编码核苷酸序列及其应用，属于合成生物学领域。本发明专利技术提供了一种合成presilphiperfolane

【技术实现步骤摘要】
一种倍半萜合酶IlTPS1，编码核苷酸序列及其应用


[0001]本专利技术属于合成生物学领域，涉及一种倍半萜合酶IlTPS1，编码核苷酸序列及其应用。

技术介绍

[0002]倍半萜类化合物是菊科植物的特征化合物和主要活性成分，具有显著的生物学和药理学活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤等，是非常重要的植物活性天然产物。其中，Presilphiperfolan-8β-ol是一种结构极其新颖的桥连三环presilphiperfolane型倍半萜化合物，同时也是很多活性显著的聚环倍半萜化合物的生物合成前体，具有极高的产业应用潜力，引起了植物化学、化学合成和药理学等领域研究者们的广泛关注，被《Natural Product Reports》立为重点研究对象。
[0003]然而，该类倍半萜化合物在自然界中分布稀少且天然含量极低，仅在少数几种植物(如旋复花属植物Inula lineariifolia)和真菌(灰霉病菌Botrytis cinerea)中被发现。原料的匮乏限制了对该类物质的开发和利用，尽管presilphiperfolan-8β-ol的化学合成已取得成功，但因其合成步骤冗长，产率较低，合成成本高，且引起环境污染等问题，仍达不到工业化生产需求。
[0004]因此，为实现presilphiperfolan-8β-ol的工业化生产及应用，挖掘合成presilphiperfolan-8β-ol的倍半萜合酶基因，继而利用合成生物学策略大量合成presilphiperfolan-8β-ol十分必要。

技术实现思路

[0005]为了有效解决presilphiperfolane-8β-ol资源稀缺及其产业应用有限的现状，本专利技术提供一种倍半萜合酶IlTPS1、编码核苷酸序列及其应用。本专利技术还具体提供了一种高产presilphiperfolane-8β-ol的酵母工程菌株。
[0006]本专利技术第一方面提供了一种倍半萜合酶IlTPS1，所述IlTPS1的氨基酸序列包含或由如下序列组成：
[0007]a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，
[0008]b)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少75％序列相似性的功能性同源序列；或
[0009]c)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个氨基酸且具有倍半萜合酶IlTPS1活性的氨基酸序列。
[0010]本申请的专利技术人通过大规模的资源筛选，从菊科药用植物线叶旋复花Inula lineariifolia中筛选分离得到了一个倍半萜合酶基因IlTPS1，并成功获得该基因的编码蛋白(本专利技术中也命名为IlTPS1)。功能分析发现IlTPS1催化底物FPP(farnesyl diphosphate，法尼基二磷酸)生成7个倍半萜类化合物，其中presilphiperfolane-8β-ol为主要产物，约占41.19％，倍半萜合酶基因IlTPS1为生产presilphiperfolane-8β-ol提供了
NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列。
[0025]示例性地，所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。
[0026]本专利技术第三方面提供了所述倍半萜合酶IlTPS1，或，所述的编码倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列在合成倍半萜，尤其是合成presilphiperfolane-8β-ol中的应用。
[0027]其中，所述倍半萜合酶IlTPS1在合成presilphiperfolane-8β-ol(倍半萜)中的应用包括以下几个方面：(1)本专利技术所提供的IlTPS1氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质；(2)涉及presilphiperfolane-8β-ol的生物合成；(3)涉及presilphiperfolane-8β-ol抑制真菌活性。
[0028]所述的编码倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列在合成presilphiperfolane-8β-ol(倍半萜)中的应用包括以下几个方面：(1)本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列被修饰或突变，修饰或突变的途径包括插入、缺失，聚合酶链式反应(PCR)，易错PCR，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过化学试剂诱变等。(2)本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。(3)本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
[0029]本专利技术第四方面提供了载体，所述载体导入了所述的核苷酸序列。
[0030]对于载体的种类不作具体限定，可以根据需要选择适合的载体。例如载体包括但不限于pESC-Ura、pESC-Trp、pESC-Leu、pESC-His、pGEX2T、pTAex3、pUSA、pYMB03或pHT43，优选pESC-Ura。
[0031]本专利技术第五方面提供了遗传工程化的宿主细胞，其包含所述的氨基酸序列，或包含所述的核苷酸序列，或导入了所述的载体。
[0032]进一步，所述的宿主细胞包括植物细胞和/或微生物细胞；
[0033]进一步，所述植物体也包括如外植体的植物部分，包括但不限于：插条、组织培养物、细胞悬浮液和愈伤组织。
[0034]进一步，所述植物更优选为旋复花、线叶旋复花细胞和发根、烟草细胞、青蒿细胞。
[0035]进一步，所述微生物细胞包括但不限于链霉菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母细胞、大肠杆菌。
[0036]进一步，在体内和体外将编码倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列，或所述的重组质粒，或所述的表达载体引入宿主细胞的方法包括但不限于电穿孔、聚乙二醇(PEG)转化、脂质转染、热休克、磷酸钙沉淀、病毒介导和显微注射。
[0037]本专利技术第六方面提供一种生产倍半萜的酵母工程菌株，该菌株包含有甲羟戊酸途径相关基因和倍半萜合成的相关基因。
[0038]进一步，所述甲羟戊酸途径的相关基因包括羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMGR，
麦角甾醇通路调控基因upc2-1和法尼基焦磷酸合酶基因FPS；所述倍半萜合成的基因包括所述IlTPS1核苷酸序列。
[0039]采用下述制备方法获得：将N末端截断的HMGR基因，upc2-1基因分别整合到酵母基因组中，替换启动子弱化分路代谢流，再将FPS基因整合到酵母基因组中，最后导入含有所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种倍半萜合酶IlTPS1，其特征在于，所述IlTPS1的氨基酸序列包含或由如下序列组成：a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，b)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少75％序列相似性的功能性同源序列；或c)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个氨基酸且具有倍半萜合酶IlTPS1活性的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的编码倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含或由如下序列组成：i)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，ii)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的互补序列、简并序列或同源序列(优选同源性80％以上)；或，iii)在严格条件下与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交，且能够编码倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列。4.权利要求1所述的倍半萜合酶IlTPS1，或，权利要求2或3任一项所述的编码倍半萜合酶IlTPS1的核苷酸序列在合成倍半萜(优选presilphiperfolane-8β-ol)中的应用。5.载体，其特征在于，包含权利要求2或3任一项所述的核苷酸序列。6.遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求1所述的氨基酸序列，或包含权利要求2或3任一项所述的核苷酸序列，或导入了权利要求5所述的载体；优选地，所述宿主细胞包括植物细胞和/或微生物细胞；优选地，所述植物细胞包括旋复花、线叶旋复花细胞、烟草...

【专利技术属性】
技术研发人员：苟君波，尚轶，黄三文，卢大均，
申请(专利权)人：中国农业科学院深圳农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：