瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法技术

本发明专利技术公开了瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：（1）制备供试品溶液，（2）以薯蓣皂苷元为标准品，制备对照品溶液，（3）HPLC检测：记录95min内的HPLC图谱。（4）对多个供试品进行检测，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，通过多点校正的方法对所有色谱峰进行匹配，将自动生成对照指纹图谱R作为对照指纹图谱。本发明专利技术通过建立益母姜的指纹图谱，能够较全面地反映益母姜所含成分的相对关系，还可以有效地对不同产地的药材进行准确区分，更好地对其质量进行评价和控制，有利于促进广西瑶药益母姜的开发和利用。

Establishment of HPLC fingerprint of dichloromethane fraction of Leonurus officinalis

【技术实现步骤摘要】
瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法
本专利技术涉及中药材指纹图谱
，具体是瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法。
技术介绍
益母姜为姜科植物闭鞘姜Costusspeciosus（Koen.）Smith的根茎，多年生宿根草本，是习用瑶药之一。瑶族民间常将其作为产妇的护理用药，对产妇的康复效果好，因此瑶民称之为“益母姜”、“观音姜”。生于海拔1700m以下的山谷、林下或林缘路边、溪边灌木草丛等潮湿处。主要分布于广西、广东、云南、福建、台湾等省区，东南亚及南亚亚热带地区也有分布。广西益母姜主要分布于来宾、百色、桂林、凭祥、桂平、贵港、钦州、南宁、玉林、柳州、梧州等地，多生于海拔较低的林下或荒坡潮湿处。益母姜能够治疗多种疾病，不仅是我国少数民族的常用中药，在印度、不丹、柬埔寨等国也有很长的药用历史，因此该药的质量评价一度成为国内外研究的热点。益母姜的性味、毒性、产地加工方面，各典籍记载不一，历版《中国药典》和瑶药标准中均未收载本品，缺乏统一的标准，这就容易造成本品性味、产地加工方法的混乱，药材的质量难以得到有效控制，从而影响其临床疗效。国内的乔春峰和苏新民等分别开展了闭鞘姜类药材的鉴别研究和傣药材闭鞘姜质量研究，PratapSingh等也对印度当地的闭鞘姜进行了生药学研究。然而本专利技术人通过对比发现，瑶药材益母姜与闭鞘姜虽为同一基源药材，但因各地区的气候、土质不同等原因，益母姜的内含物存在较大差异，使得已有的鉴别方法不能对益母姜药材的质量进行有效控制，无法对广西地区益母姜药材的质量进行准确评价。瑶药益母姜应用广泛，但因缺乏规范可行的质量评价方法，使得其疗效差异较大，影响其进一步开发和利用。中药的指纹图谱是具有高度专属性的一种特征图谱，能够比较全面地表征药材成分的相对关系，目前已经成为公认的质量控制的有效手段。同一基原药材的生长环境、采收季节以及贮藏条件不同，其指纹图谱也会有所差别。目前国内外现有技术中尚无益母姜指纹图谱的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种瑶药材益母姜的质量评价方法，通过建立益母姜的指纹图谱，能够较全面地反映益母姜所含成分的相对关系，还可以有效地对不同产地的药材进行准确区分，更好地对其质量进行评价和控制，促进广西瑶药益母姜的开发和利用。为了有效控制瑶药材益母姜的质量，本专利技术对广西11批不同产地益母姜药材的原植物形态、药材性状、显微特征、薄层鉴别、项目检查、含量测定等方面进行质量评价，建立其质量标准，为广西瑶药材益母姜的进一步开发利用提供科学的依据。本专利技术通过以下技术方案实现：瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：（1）制备供试品溶液：准确称取益母姜药材2.0000g，精密加入体积分数为70%的乙醇溶液50ml，称定重量，超声60min，放冷后称重，补足减失的重量，滤过，滤液精密加入3mol/ml的盐酸溶液20ml，水浴回流2h，放冷后，用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调至中性，水浴蒸干，残渣用30ml热水溶解并转移至分液漏斗中以三氯甲烷萃取，萃取2次，每次30ml，合并三氯甲烷部分，挥干，残渣用甲醇定容至10ml棕色容量瓶中，进样前以0.22µm有机滤膜滤过，即得；（2）制备对照品溶液：精密称定薯蓣皂苷元标准品适量，用甲醇溶解，制成1ml含薯蓣皂苷元0.428mg的对照品溶液，于棕色的容量瓶中储存，进样前以0.22µm有机滤膜滤过，即得；（3）HPLC检测：分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，根据色谱条件进行高效液相色谱检测，记录95min内的HPLC图谱；其中，所述的色谱条件为：色谱柱ODS-SPC18（250×4.6nm，5m）；检测波长203nm；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样量10l；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%磷酸；梯度洗脱条件如下：0～10min，5%A+95%B；10～40min，20%A+80%B；40～65min，70%A+30%B；65～95min，95%A+5%B；百分数表示流动相A和B所占的体积百分比。（4）对多个供试品进行检测，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，通过多点校正的方法对所有色谱峰进行匹配，将自动生成对照指纹图谱R作为对照指纹图谱。一、对本专利技术指纹图谱的色谱条件考察如下：1、流动相的选择益母姜药材的化学成分较为复杂，本专利技术采用了梯度洗脱的方法分别对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸四种流动相系统进行考察，以色谱峰的分离效果为考察指标，找到适合的流动相。结果如图1所示。实验结果显示，以甲醇作为流动相时，色谱图基线严重漂移，且色谱峰的数目较少；以乙腈-水流动相系统洗脱得到的色谱图干扰峰较多，分离度较差。综合考虑。最后选定以乙腈-0.1%磷酸流动相系统进行梯度洗脱。2、检测波长的选择为了获得更多益母姜药材的化学信息，检测波长的选择尤为重要。本专利技术以色谱图峰的数量、丰度、基线漂移情况等为考察指标，分别对196nm、203nm、206nm、208nm、225nm五种不同波长进行考察，选择适合的检测波长。结果如图2所示。实验结果显示，检测波长越小，色谱峰的峰高越高，但基线也会漂移增加。当检测波长为196~208nm时，各色谱图的峰数量一致，当以225nm为检测波长时，色谱峰数目明显减少。结合各检测波长下的色谱图，最终选择以203nm作为检测波长。3、进样量、柱温、流速、分析时间的选择本专利技术还对色谱条件的不同柱温（25、30、25℃）；不同样品进样量（5、10、15、20l）；不同流速（0.5、0.8、1.0、1.2ml/min）分别进行了考察，对比各条件下的色谱图，综合考虑峰型、保留时间、分离度、峰高等因素，确定以20l为进样量，柱温30℃，流速为0.8ml/min进行益母姜指纹图谱的测定。结果如图3、4、5所示。按照相同的色谱条件对样品溶液进行120min的色谱分析发现，95min后色谱图再无滞后峰出现，故选择以95min作为该指纹图谱的分析时间。综上，最终确定的益母姜指纹图谱最佳色谱条件为：色谱柱ODS-SPC18（250×4.6nm，5m）；检测波长：203nm；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；进样量：10l。二、对本专利技术方法学的考察1、精密度考察取同一供试品溶液，重复进样6次，按本专利技术的色谱条件进行测定。计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积及其RSD值，结果见表1、表2。表1精密度试验-相对保留时间（n=6）表2精密度试验-相对峰面积（n=6）由表1、表2可知，6次进样各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.00%，表明仪器精密度良好。2、重复性试验取同一批次（YMJ-6，20180920）益母姜药材6份，按本专利技术供试品溶液的制备方法制备供试液，依次进样，以本专利技术的色谱条件进行检测。计算6份指纹图谱各主要色谱峰的相对保留时间及其RSD值，结果见表3、表4。表3重复性试验-相对保留时间表4重复性试验-相对峰面积结果显示，各色谱峰的相对保留时间的RSD值均小于3.00%，表明该样品制备方法重复性好。稳定性试验按照本专利技术供试品溶液的制备方法新鲜制备一份供试液，以本专利技术的色谱条件分别于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）制备供试品溶液：准确称取益母姜药材2.0000 g，精密加入体积分数为70%的乙醇溶液50ml，称定重量，超声60 min，放冷后称重，补足减失的重量，滤过，滤液精密加入3 mol/ml的盐酸溶液20 ml，水浴回流2 h，放冷后，用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调至中性，水浴蒸干，残渣用30 ml热水溶解并转移至分液漏斗中以三氯甲烷萃取，萃取2次，每次30 ml，合并三氯甲烷部分，挥干，残渣用甲醇定容至10 ml棕色容量瓶中，进样前以0.22 µm有机滤膜滤过，即得；（2）制备对照品溶液：精密称定薯蓣皂苷元标准品适量，用甲醇溶解，制成1 ml含薯蓣皂苷元0.428 mg的对照品溶液，于棕色的容量瓶中储存，进样前以0.22 µm有机滤膜滤过，即得；（3）HPLC检测：分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，根据色谱条件进行高效液相色谱检测，记录95min 内的HPLC 图谱；（4）对多个供试品进行检测，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，通过多点校正的方法对所有色谱峰进行匹配，将自动生成对照指纹图谱R作为对照指纹图谱。...

【技术特征摘要】
1.瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）制备供试品溶液：准确称取益母姜药材2.0000g，精密加入体积分数为70%的乙醇溶液50ml，称定重量，超声60min，放冷后称重，补足减失的重量，滤过，滤液精密加入3mol/ml的盐酸溶液20ml，水浴回流2h，放冷后，用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调至中性，水浴蒸干，残渣用30ml热水溶解并转移至分液漏斗中以三氯甲烷萃取，萃取2次，每次30ml，合并三氯甲烷部分，挥干，残渣用甲醇定容至10ml棕色容量瓶中，进样前以0.22µm有机滤膜滤过，即得；（2）制备对照品溶液：精密称定薯蓣皂苷元标准品适量，用甲醇溶解，制成1ml含薯蓣皂苷元0.428mg的对照品溶液，于棕色的容量瓶中储存，进样前以0.22µm有机滤膜滤过，即得；（3）HPLC检测：分别吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志萍，黄杰连，黎芳，苏佳昇，李晓霞，蒋雅娴，刘笑，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：广西,45