RPRM基因敲除小鼠模型及其构建方法与应用技术

本发明专利技术揭示了一种RPRM基因敲除小鼠模型，所述小鼠模型是被敲除了RPRM（又名Reprimo）基因的小鼠，同时揭示了一种RPRM基因敲除小鼠模型的构建方法，通过对小鼠待敲除基因的靶位点的确定及sgRNA的设计，并进行扩增、活性测试后，将有活性的sgRNA和Cas9注入小鼠体内进行小鼠模型的建立。本发明专利技术获得的RPRM基因敲除小鼠为RPRM在胚胎发育中的功能、对组织和个体放射敏感性的影响及其在肿瘤发生发展中的作用等方面的研究提供可靠的动物模型。

RPRM gene knockout mouse model and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
RPRM基因敲除小鼠模型及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种RPRM基因敲除小鼠模型及其构建方法与应用，属于生物

技术介绍
RPRM基因家族包括RPRM、RPRML、RPRM3，其中RPRM和RPRML在大多数脊椎动物中都有表达。实验和临床证据表明，只有RPRM在人类肿瘤发生过程中具有重要的生物学功能。RPRM是含有单一外显子不含有内含子的基因，其基因组DNA位于染色体2q23.2的负股链上，有1.4kb，编码109个氨基酸，表达产物长度为11.774kDa。RPRM是一个高度糖基化蛋白，在第7和第18个氨基酸具有两个N端糖基化位点，在第82个氨基酸上有一个预测的sumo化位点，在第98个丝氨酸上具有一个可能的磷酸化位点。RPRM主要定位于细胞质中。RPRM基因在人体多种组织器官中均有表达，尤其是在血管和脑组织、内分泌组织、肌肉组织、生殖系统及消化系统组织中表达较高，提示其在人类胚胎组织发育中可能发挥重要功能。RPRM最初是从经过X射线照射后的含有野生型p53的小鼠胚胎成纤维细胞中首次分离发现的。功能学研究表明，RPRM是p53的一个转录调控靶点，其诱导表达后通过抑制Cdc2·CyclinB1的核转运而引起细胞G2/M期阻滞。进一步的研究发现RPRM通过引发细胞周期阻滞、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等多重机制参与调控细胞生长，在调节细胞和组织的动态平衡包括增殖、细胞存活等的信号通路中起着重要作用。并且，在肿瘤细胞中外源性高表达RPRM之后，肿瘤细胞增殖受到明显抑制，表现为克隆形成能力降低。除此之外，高表达RPRM的肿瘤细胞侵袭、迁移能力减弱，凋亡增加。在联合DNA损伤诱导剂或者电离辐射的情况下，RPRM促进肿瘤细胞凋亡，抑制细胞生长的作用更加明显，肿瘤生长受限，肿瘤体积明显缩小，提示RPRM具有增加肿瘤细胞DNA损伤和放射敏感性的作用。另外，对临床样本的研究显示RPRM在胃癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、结直肠癌等多种肿瘤中由于其启动子异常高度甲基化而导致RPRM在这些肿瘤组织中低表达甚至缺失。这些研究结果提示RPRM是一个抑癌基因。尽管已有以上研究结果，但是目前对于RPRM及其家族尚存在很多未知功能及其调控机制需要进一步探索。对RPRM的功能及相关机制的研究对于更好地理解人类胚胎发育、组织和个体对电离辐射的敏感性和肿瘤的发生发展等具有重要的理论意义，同时，对于临床肿瘤病人的诊断和治疗也具有非常重要的现实意义。而由于伦理学限制，很多研究无法在人体中进行，为了更深入地研究这一抑癌基因的重要生理学功能需要借助一定的动物模型来模拟人体的情况。而最常见的疾病动物模型和药理实验动物模型就是啮齿类的小鼠。RPRM氨基酸序列在人和小鼠中的相似度高达97.25％(www.ncbi.nlm.nih.gov)，具有高度保守性，可作为研究RPRM功能的良好的动物模型。且目前还没有关于RPRM基因敲除小鼠模型的报道。
技术实现思路
鉴于现有技术存在上述缺陷，本专利技术采用第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9系统，通过Cas9蛋白结合成熟的crRNA形成复合物，实现对RPRM基因序列的识别和切割，构建RPRM基因敲除小鼠。由于CRISPR/Cas9系统的高精准和易操作等优势已成为实现基因编辑和动物模型构建的最好方法。本专利技术的目的，将通过以下技术方案得以实现：一种RPRM基因敲除小鼠模型，所述小鼠模型是被敲除了RPRM基因的小鼠。优选地，一种RPRM基因敲除小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：S1、确定小鼠待敲除基因的靶位点，设计针对RPRM-s1、RPRM-s2、RPRM-s3、RPRM-s4的sgRNA，所述RPRM-s1的sgRNA序列如SEQIDNO.1所示；所述RPRM-s2的sgRNA序列如SEQIDNO.2所示；所述RPRM-s3的sgRNA序列如SEQIDNO.3所示；所述RPRM-s4的sgRNA序列如SEQIDNO.4所示；S2、将S1中设计的sgRNA进行体外扩增构建表达sgRNA的质粒；S3、sgRNA体外活性测试；S4、将有活性的sgRNA和Cas9通过显微注射直接注入小鼠受精卵中；取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；S5、F0代小鼠与正常野生型雌鼠回交后得到F1代敲除RPRM基因的小鼠。优选地，所述S2包括如下步骤：S21、将S1中设计好的sgRNA以梯度降温的方式退火成双链后，与质粒连接，以DH5α大肠杆菌为载体进行转化操作，进行平板涂板；S22、将S21中的平板在培养箱中孵育过夜，选取单克隆接种于培养液中，并收集菌液进行质粒提取，进行PCR鉴定阳性克隆。优选地，所述S3中采用PrecutpSG-targetCloningkit&SSAassay试剂盒对sgRNA的剪切活性进行体外检测。优选地，所述S4中的小鼠采用C57BL/6J品系小鼠。优选地，一种RPRM基因敲除小鼠模型在抑癌基因模型中的应用。本专利技术产生的技术效果是：本专利技术获得的RPRM基因敲除小鼠为RPRM在胚胎发育中的功能、对组织和个体放射敏感性的影响及其在肿瘤发生发展中的作用等方面的研究提供可靠经济的动物模型。以下便结合实施例附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详述，以使本专利技术技术方案更易于理解、掌握。附图说明图1：本专利技术基因敲除策略图。图2：本专利技术中实施例中基因敲除策略图。图3：对F0代雄鼠与正常野生型雌鼠回交后得到F1代小鼠进行电泳鉴定图。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术的方法进行说明，以使本专利技术技术方案更易于理解、掌握，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本专利技术揭示了一种RPRM基因敲除小鼠模型，所述小鼠模型是被敲除了RPRM(又名Reprimo)基因的小鼠。该小鼠模型基因敲除策略如图1所示，所述小鼠为C57BL/6J品系，敲除基因名称(NCBI号)：Reprimo(67874)，敲除基因名称(MGI号)：Rprm(1915124)。敲除的外显子(exon)：exon1。本专利技术还揭示了一种RPRM基因敲除小鼠模型的建立方法，包括如下步骤：首先，确定待敲除基因的靶位点和sgRNA的设计：设计针对RPRM-s1、RPRM-s2、RPRM-s3、RPRM-s4的sgRNA，所述RPRM-s1的sgRNA序列如SEQIDNO.1所示；所述RPRM-s2的sgRNA序列如SEQIDNO.2所示；所述RPRM-s3的sgRNA序列如SEQIDNO.3所示；所述RPRM-s4的sgRNA序列如SEQIDNO.4所示。其中RPRM-s1的序列为反向序列。野生型RPRM基因序列为SEQIDNO.5，其下划线部分为外显子，外显子序列为SEQIDNO.6。SEQIDNO.5：然后，对设计的sgRNA体外扩增后构建表达sgRNA的质粒：将设计好的sgRNA以梯度降温的方式退火成双链后与质粒连接，所述质粒为大肠杆菌。以DH5α大肠杆菌为载体进行转化操作，进行LB平板涂板。平板置于37℃细菌培养箱中孵育过夜。随后在无菌操作台挑取平板上的单克隆10个，接种于LB培养液中，在37℃，160rpm恒温摇床中培养过夜。之后收集菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RPRM基因敲除小鼠模型，其特征在于：所述小鼠模型是被敲除了RPRM基因的小鼠。

【技术特征摘要】
1.一种RPRM基因敲除小鼠模型，其特征在于：所述小鼠模型是被敲除了RPRM基因的小鼠。2.一种RPRM基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、确定小鼠待敲除基因的靶位点，设计针对RPRM-s1、RPRM-s2、RPRM-s3、RPRM-s4的sgRNA，所述RPRM-s1的sgRNA序列如SEQIDNO.1所示；所述RPRM-s2的sgRNA序列如SEQIDNO.2所示；所述RPRM-s3的sgRNA序列如SEQIDNO.3所示；所述RPRM-s4的sgRNA序列如SEQIDNO.4所示；S2、将S1中设计的sgRNA进行体外扩增构建表达sgRNA的质粒；S3、sgRNA体外活性测试；S4、将有活性的sgRNA和Cas9通过显微注射直接注入小鼠受精卵中；取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；S5、F0代小鼠与正常野生型...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨红英，张雅瑞，王敬东，张力元，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32