一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法，以GH63基因作为特异性分子标记，设计出扩增有害疣孢霉的特异性引物，通过PCR扩增的方法在病害还未发生之前快速检测双孢蘑菇覆土层中是否存在有害疣孢霉孢子，对于双孢蘑菇疣孢霉病害的防治有着积极的作用，也解决了传统方法时效性差的不足。

A Primer and Method for Rapid Detection of Verruca Bispora Pathogens in Soil Covering

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法
本专利技术属于病原微生物检测
，具体涉及一种快速检测双孢蘑菇覆土中有害疣孢霉病病原菌的引物及方法。
技术介绍
双孢蘑菇(Agaricusbisporus)是世界上广泛栽培的食用菌，但在生长过程中易发生双孢蘑菇疣孢霉病，常造成严重的经济损失，影响双孢蘑菇产业的经济效益。双孢蘑菇疣孢霉病，是双孢蘑菇栽培过程中的重要病害，常影响着双孢蘑菇的产业，造成严重的经济损失，它的病原菌有害疣孢霉(Hypomycesperniciosus)是常见的土壤真菌，传播途径主要是通过厚垣孢子传播，而厚垣孢子主要存在于覆土中，它的适应能力很强，菇房周围的废弃物和土壤成了该病害的最初主要的侵染来源，有害疣孢霉的分生孢子、厚垣孢子及菌丝体都有致病的能力，并且覆土中病原孢子量也会影响疣孢霉病的发病率。目前常用的双孢蘑菇有害疣孢霉病原菌的鉴定方法主要是通过采集双孢蘑菇覆土样品，进行微生物分离培养，之后通过不断地纯化，得到病原菌的纯培养物，再进行形态观察，并提取真菌DNA，进行ITS扩增，测序后对序列进行比对鉴定后判断其为有害疣孢霉，此方法往往费时费力，操作繁琐，程序复杂，得到结果的时候已经错过了最佳的防治时期，所以通过提取土壤中的真菌总DNA，利用有害疣孢霉的特异性分子标记，运用PCR技术(聚合酶链式反应)在病害还未发生之前来判断病原菌的有无至关重要，该方法简便省事，程序简单。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种基于PCR技术定性检测双孢蘑菇覆土中有害疣孢霉病原菌的引物及方法，所述方法可以快速检测到双孢蘑菇覆土材料中的有害疣孢霉孢子，在病害发生之前发现病害，提前进行防治，为双孢蘑菇疣孢霉病害的病害预警提供技术支持。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：根据GH63基因设计引物GH63-F(SEQIDNO.1)和GH63-R(SEQIDNO.2)，用作快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物。一种检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的方法，包括以下步骤：(1)采集双孢蘑菇覆土，提取土壤总DNA；(2)以土壤总DNA为模板，使用引物GH63-F(SEQIDNO.1)和GH63-R(SEQIDNO.2)进行PCR扩增；(3)将扩增产物进行核酸电泳检测，如果土壤样品中检测到326bp的扩增条带，则说明覆土中存在有害疣孢霉病原真菌。优选地，上述检测方法步骤(1)中双孢蘑菇覆土在PDA液体培养基中扩大培养后再提取土壤总DNA。优选地，上述检测方法中PCR程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃，10min，4℃保存。相比于现有技术，本专利技术具有的有益效果如下：1、本专利技术根据有害疣孢霉基因组的注释信息找到GH63基因序列，比较近缘物种的GH63同源基因，设计出扩增有害疣孢霉的特异性引物，应用该引物以双孢蘑菇覆土DNA为模板获得长度为326bp的有害疣孢霉特异性产物。2、通过PCR扩增的方法快速检测双孢蘑菇覆土层中是否存在有害疣孢霉孢子，进行提前防治，对于双孢蘑菇疣孢霉病害的防治有着积极的作用，也解决了传统方法时效性差的不足。附图说明图1是本专利技术实施例1步骤(1)中GH63引物扩增后的电泳图。M：BM2000Marker，泳道1-9依次为深绿木霉，哈茨木霉，绿色木霉，矩孢木霉，长枝木霉，Cladobotryumcubitense，Cladobotryumprotrusum，Cladobotryumsp.，有害疣孢霉，泳道10为不含DNA的阴性对照。图2是本专利技术实施例1步骤(2)中引物灵敏度测试图。M：BM2000Marker，泳道1-12是PCR反应体系中有害疣孢霉总DNA含量依次为100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0ng。图3是本专利技术实施例1步骤(4)中GH63引物扩增土壤DNA后的电泳图。M：BM2000Marker，泳道1-3：分别是土壤DNA样品，有害疣孢霉DNA，阴性对照。图4是本专利技术实施例2步骤(1)的ITS引物扩增图。M：BM2000Marker，泳道1-12分别是接种了有害疣孢霉孢子悬液后随机采集的土壤DNA样品，泳道13为有害疣孢霉DNA，泳道14为阴性对照。图5是本专利技术实施例2步骤(2)的GH63引物扩增后的电泳图。M：BM2000Marker，泳道1-12分别是接种了不同浓度有害疣孢霉孢子悬液后随机采集的土壤DNA样品，泳道13为有害疣孢霉DNA，泳道14为阴性对照。具体实施方式实施例1特异性引物设计和检测方法：(1)根据病原菌有害疣孢霉的真菌基因组注释信息，找到一些常用于种间鉴定的和物种系统发育研究的保守基因，将这些基因序列与近缘物种的直向同源基因序列作比较分析，利用同源基因之间的序列差异，使用PrimerPrimier5.0软件设计引物，用所设计的引物对有害疣孢霉菌株、5个木霉菌株、3个蛛网病病原菌菌株的DNA作PCR扩增，只有根据GH63基因设计的引物GH63-F(SEQIDNO.1)和GH63-R(SEQIDNO.2)在有害疣孢霉中扩增出特异性条带，而在木霉和蛛网病病原菌无扩增产物。PCR反应体系为共20μL，其中2×TaqPlusMasterMix(南京诺唯赞生物科技有限公司)10μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O补足总体积至20μL；PCR程序为预变性95℃，5min，变性：95℃，30s，退火：57℃，30s，延伸：72℃，1min，35个循环，72℃，10min，4℃保存。(2)灵敏性测试：每个PCR反应体系中分别添加100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0ng的有害疣孢霉菌株的DNA进行引物的灵敏度测试，结果表明，GH63引物的灵敏性很高，仅0.05ng的DNA模板就可以扩增出目的条带。(3)申请人从湖北亚菌园生物科技有限公司基地取样，获取双孢蘑菇覆土，称取8g新鲜土壤到PDA液体培养基中培养2d，进行病原菌的扩繁培养。(4)利用E.Z.N.A.soilDNAKit(购于OmegaBio-tek公司)，提取扩繁后土壤总DNA，并将总DNA溶解于ddH2O中；以GH63-F和GH63-R分别做为上下游引物，以土壤总DNA为模板，进行目的条带扩增；PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳，土壤样品中检测到326bp的单一PCR产物，将PCR产物送到测序公司测序，核苷酸序列如SEQIDNO.3，确定GH63-F和GH63-R扩增土壤样品获得的产物为特异性的单一产物，且与有害疣孢霉GH63基因的序列完全相同。实施例2设置有害疣孢霉孢子悬浮液浓度梯度为102、104、106个/mL，以孢子稀释液(水)为对照，各处理3次重复，接种到刚覆土床架的覆土表面，每个小区30mL，每个处理之间用塑料板隔开，共12个小区，每个小区的面积相等(1.4×1.5m2)。(1)在试验区域随机取样，在PDA液体培养基中培养2d后，进行病原菌的扩繁培养，提取土壤DNA，进行ITS扩增，每个样品可以扩增出多条条带，说明提取的土壤DNA可以用于PCR扩增。(2)将土壤DNA样品用引物GH63-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物，其特征在，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物，其特征在，引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.利用权利要求1所述的引物检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集双孢蘑菇覆土，提取土壤总DNA；(2)以土壤总DNA为模板，使用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周雁，李佳璐，边银丙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42