一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记、引物对及鉴别方法技术

本发明专利技术提供了一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记、引物对、PCR试剂、试剂盒及其在雷公藤药材鉴别中的用途，其中，所述分子标记为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述引物对能够扩增出SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了一种雷公藤药材的鉴别方法，通过采用以上分子标记、引物对、PCR试剂、PCR试剂盒及鉴别方法，通过检测是否扩增出分子标记即可完成雷公藤药材的鉴别，且可重复性高，克服了传统鉴别方法主观性强、重复性差的缺陷。

A molecular marker, primer pair and identification method for Tripterygium wilfordii

【技术实现步骤摘要】
一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记、引物对及鉴别方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记、引物对及鉴别方法。
技术介绍
雷公藤是卫矛科(Celastraceae)雷公藤属(Tripterygium)植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的去皮干燥根，具有良好的抗炎，抗风湿，免疫调节等功效，是临床上常用的免疫抑制剂之一。现代药理学研究中，雷公藤还具有潜在治疗阿尔兹海默症以及抗HIV、抗癌作用。由于雷公藤具有显著的生物活性，蕴含了巨大的药用价值，近年来，已成为国内外学者的研究热点。雷公藤为根茎类药材，目前市面上常用的混伪品有东北雷公藤，猕猴桃根，南蛇藤等。目前，对于雷公藤药材的植物来源存在一定争议，在中国植物志中文版中卫矛科雷公藤属有三个植物来源，分别为雷公藤TripterygiumwilfordiiHook、昆明山海棠T.hypoglaucum(Levl.)和东北雷公藤T.regelliiSpragueetTakeda。修订版《FloraofChina》将上述3个种合并为雷公藤T.wilfordii。但目前，东北雷公藤尚无用药历史。斯金平等观察到雷公藤与昆明山海棠植物在植物形态特征和地理分布上具有渐变的趋势，存在大量的中间类型，仅仅通过叶大小，叶被白粉的有无等特征已经很难将二者划分开来。刘超等研究表明雷公藤与昆明山海棠根的代谢产物特征呈现一定的地域性，二者整体代谢轮廓上并没有明显的界限存在。刘万水等通过RAPD分析发现雷公藤与昆明山海棠的种间界限模糊，SueKa-Yee通过ITS和5SrDNA序列表明雷公藤与昆明山海棠区分不明显。高伟等对40个地理位置120个雷公藤、昆明山海棠和东北雷公藤样本DNA的psbA-trnH、rpl32-trnH、trnL-trnF、matK、ITS序列进行系统进化分析结果表明，雷公藤属植物遗传距离和地理距离显著相关，昆明山海棠为复系类群，雷公藤为并系类群，建议将雷公藤属植物归为两类，雷公藤和昆明山海棠合并为一类。因此本专利技术以雷公藤TripterygiumwilfordiiHook及昆明山海棠T.hypoglaucum(Levl.)作为雷公藤药材的正品来源进行研究。中国专利文献CN106434976A公开了一种山药真伪鉴别的方法及专用引物，提供了用于山药真伪鉴别的专用引物，并对正品山药特异性鉴别引物进行PCR条件优化，通过优化退火温度、变性温度、变性时间、退火时间及循环数等影响因素，使山药的分子鉴定在30min以内即可完成。然而目前，还没有可用于雷公藤真伪鉴别的分子标记、专用引物和高效、可靠的分子鉴定方法，雷公藤的真伪鉴别体系有待建立。目前，正品雷公藤的鉴别普遍采用的是传统方法，如性状鉴别、显微鉴定等，但主观性强，重复性差，在雷公藤的真伪鉴别中具有一定的局限性。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的第一个技术问题在于克服现有技术中雷公藤鉴别传统方法主观性强，重复性差的缺陷，从而提供一种不需要依靠主观判断、特异性强、重复性高的用于雷公藤鉴别的分子标记、引物对、PCR试剂和试剂盒。本专利技术还提供了用于雷公藤鉴别的分子标记、引物对、PCR试剂、试剂盒在雷公藤药材鉴别中的用途。本专利技术要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中雷公藤药材传统真伪鉴别方法主观性强，重复性差的缺陷，从而提供一种不需要依靠主观判断、方法稳定、重复性强、高效、可靠的雷公藤药材鉴别的方法。为此，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术提供了一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记，所述分子标记为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种用于雷公藤药材鉴别的引物对，所述引物对能够扩增得到SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。所述的用于雷公藤药材鉴别的引物对，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列；所述引物2为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列。本专利技术提供了一种用于雷公藤药材鉴别的PCR试剂，包括所述的引物对、DNA聚合酶和/或dNTPs。优选的，所述PCR试剂，包括：2×TaqplusMasterMixII，25μL；引物1，浓度为6.4ng/μL，2μL；和引物2，浓度为6.4ng/μL，2μL。本专利技术提供了一种用于雷公藤药材鉴别的试剂盒，包括所述的用于雷公藤药材鉴别的引物对或包括所述的用于雷公藤药材鉴别的PCR试剂。本专利技术提供了如下a1-a4在雷公藤药材鉴别中的用途:a1.所述的用于雷公藤药材鉴别的分子标记；a2.所述的用于雷公藤药材鉴别的引物对；a3.所述的用于雷公藤药材鉴别的PCR试剂；或a4.所述的用于雷公藤药材鉴别的试剂盒；优选的，所述的用途包括：鉴定或辅助鉴定待测样品是否为雷公藤药材；或鉴别或辅助鉴别雷公藤药材及其伪品。本专利技术提供了一种雷公藤药材的鉴别方法，包括对待测雷公藤药材进行所述的用于雷公藤药材鉴别的分子标记的检测。所述的雷公藤药材的鉴别方法，包括，S1、采用所述的引物对，对待测雷公藤药材的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物；S2、检测所述扩增产物中是否含有所述的SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；如果含有，则待测药材为或候选为雷公藤药材；如果不含有，则待测药材不为或候选不为雷公藤药材。所述的雷公藤药材的鉴别方法，S2步骤中，检测所述扩增产物的大小，若大小为401bp，则所述扩增产物中含有所述的SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，若大小不为401bp，则所述扩增产物中不含有所述的SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。所述的雷公藤药材的鉴别方法，所述PCR扩增反应的DNA模板为所述待测药材的基因组DNA，所述PCR扩增反应的条件为，94℃，预变性1min；92℃，变性20s，55℃，退火15s，30个循环；72℃，最后延伸30s。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记，所述分子标记为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，所述分子标记能够将雷公藤正品与其他伪品准确的分开，且克服了由于ITS序列存在大量重复序列导致其PCR扩增易产生非特异扩增产物而不利鉴定的缺陷，可在短时间内进行大量的雷公藤药材鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够克服现有技术中雷公藤鉴别传统方法主观性强，重复性差的缺陷。2.本专利技术提供的一种用于雷公藤药材鉴别的引物对，所述引物对能够扩增得到SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，通过采用该引物对，雷公藤药材正品可特异性地扩增出SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，而其他伪品无法扩增得到SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，特异性强，通过是否扩增出SEQIDNO.3所示的核苷酸序列即可完成雷公藤药材的鉴别，不需要主观判断，且可重复性高，克服了传统鉴别方法主观性强、重复性差的缺陷。3.本专利技术提供的一种用于雷公藤药材鉴别的引物对，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列中删除和/或增加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于雷公藤药材鉴别的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。2.一种用于雷公藤药材鉴别的引物对，其特征在于，所述引物对能够扩增得到SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的用于雷公藤药材鉴别的引物对，其特征在于，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列；所述引物2为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，或为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列中删除和/或增加和/或改变至少一个核苷酸得到的核苷酸序列。4.一种用于雷公藤药材鉴别的PCR试剂，其特征在于，包括权利要求2或3所述的引物对、DNA聚合酶和/或dNTPs；优选的，所述PCR试剂，包括：2×TaqplusMasterMixII，25μL；引物1，浓度为6.4ng/μL，2μL；和引物2，浓度为6.4ng/μL，2μL。5.一种用于雷公藤药材鉴别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的用于雷公藤药材鉴别的引物对或包括权利要求4所述的用于雷公藤药材鉴别的PCR试剂。6.如下a1-a4在雷公藤药材鉴别中的用途:a1.权利要求1所述的用于雷公藤药材鉴别的分子标记；a2.权利要求2或3所述的用于雷公藤药材鉴别的引物对；a3...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晶凡，张辉，马俊，谭沛，王勇，陈随清，
申请(专利权)人：华润三九医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44