本发明专利技术公开了一种鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记及其应用方法。本发明专利技术的特异性分子标记为MDYX01F/MDYX01R。以特异性标记引物MDYX01F/MDYX01R作为扩增引物，通过常规PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳检测，可以高效、准确的鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗。MDYX01F/MDYX01R为曼迪亚红豆杉雄性幼苗的特异性扩增引物，若待测样品为雄性单株，则会扩增出610bp大小的特异性DNA电泳条带；若待测样品为雌性单株，则为阴性反应。本发明专利技术方法操作简单，用时短，且结果准确，是鉴别早期曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的高效分子辅助手段。
A Specific Molecular Marker for Identifying Male and Female Seedlings of Taxus Mandiana and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记及其应用方法
本专利技术属于植物分子鉴定领域，具体涉及一种鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记及应用方法
技术介绍
曼地亚红豆杉(Taxusmadia)隶属红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(TaxusLinn)，为第四纪冰川时期孑遗植物，是珍稀濒危的常绿药用植物。曼迪亚红豆杉具有很高的药用价值，其富含紫杉烷二萜类化合物，其中紫杉醇是一种疗效良好的抗癌新药，它对卵巢癌、乳腺癌、肺癌及胃肠癌等有显著功效。曼迪亚红豆杉紫杉醇含量高达0.03～0.04％，这要远高于国内其他红豆杉树种(0.01～0.02％)，因此，曼迪亚红豆杉是提取紫杉醇非常好的原料。除此之外，曼迪亚红豆杉还具有非常高的观赏价值，常被用于园林景观设计、城市环境美化。曼地亚红豆杉是雌雄异株植物，因此，在植树造林时合理培育和布局曼迪亚红豆杉雌雄幼苗，对曼迪亚红豆杉树种的保护，以及对其经济价值的提高都具有非常重要的意义。然而，目前对于雌雄红豆杉的鉴别还缺少十分有效的手段，尤其是在幼苗早期。本专利技术人之前的一个专利技术专利(CN104480210A)公开了一种鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法。CN109486980A公开了一种用于鉴定曼地亚红豆杉的SNP分子标记，建立起了快速鉴定曼地亚红豆杉的体系。这两个专利技术专利虽然分别提供了曼迪亚红豆杉的一种鉴别方法，但是这两种方法只能区分曼迪亚红豆杉与其他红豆杉树种，而无法鉴别不同雌雄曼迪亚红豆杉之间的不同。杨马进等通过枝条和叶片形态特征对引种驯化20年的曼地亚红豆杉雌雄性别进行了鉴别(杨马进等，曼地亚红豆杉雌雄株枝条与叶片形态特性研究，四川林业科技，2016，37：37～40)。然而，茎、叶形态特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，更何况早期曼迪亚红豆杉幼苗在形态特征差别非常小，因此，仅靠形态差异特征难以准确鉴别曼迪亚红豆杉雌雄植株。本专利技术从分子生物学层面入手，对曼迪亚红豆杉雌雄植株进行研究，成功开发出了可用于曼迪亚红豆杉幼苗性别鉴别的分子特异性标记引物。对曼迪亚红豆杉的种质鉴定、资源保护及品种选育等具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种用于鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记，利用该分子特异性标记引物对能够有效的对曼迪亚红豆杉植株进行早期性别鉴定。本专利技术的第一个目的提供一种用于鉴别早期曼迪亚红豆杉雌雄的特异性分子标记引物，其特征在于该引物的核苷酸序列如下：上游引物MDYX01F:5’-TCGCGCCTTTGGACGGGTGCAC-3’，如SEQIDNO.1所示；下游引物MDYX01R:5’-GCACAAATCCGTGACCCCATG-3’，如SEQIDNO.2所示；为得到鉴别曼迪亚红豆杉雌、雄个体的特异性分子标记引物，前期我们应用了多种分子标记技术手段，并且进行了大量的PCR扩增及电泳筛选实验。最后发现，经过对曼迪亚雄、雌红豆杉样品基因组总DNA进行ITS-PCR扩增，然后，通过测序获得曼迪亚雄、雌红豆杉个体的ITS序列，最后，通过个体间ITS序列的碱基差异比对，发现曼迪亚红豆杉雌、雄个体间的ITS序列存在碱基差异，并且在此基础上，设计获得了特异性标记引物(MDYX01F/MDYX01R)。上述引物对具有极高的专一性，用此对引物对曼迪亚雌、雄单株进行PCR扩增，只有从雄株个体中获得610bp大小的特异性DNA片段，而雌株个体中无条带出现。其雄株扩增获得的特异性片段核苷酸序列SEQIDNO.3所示：TCGCGCCTTTGGACGGGTGCACCTGCGTACGTCGCCGGGCGGGACGACCGTCCACTGGTTCCGTTCTCATCTGTTCGGTCTCCGGCCTTTCGACACTCCGGGGCGGGGACACCCTTTCTCCGATTTTCCCCCACGGGGCATCGCCTCTGGTTGCAGGGGGGCGTCGAGTGGAGGTGCGTGTCATAACACTCAACGCATCGGTGCGGATTGCACCAAGGATCTGATAAATAGCTGTGCGGGCTGCGCGCCATGCGCGCGTCGGACTCACGGCGCCAATTAAACACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCCACGATGAAGAATGTAGCGAAATGCGATACTTAGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCGAGGGCACGTCTGCTTGGGCGTCGCACTCTAAAATCGACTTCCCCCGTTCCTCGGCGGGAGGATCGGAGATGGCTGTCCGTGCCCACCAGCGGCGCGGTCGGCTCAAATGGGCACGAGATTTGTGGCCGATGTCACGATGAGCGGTGGCCAATGTTGGTCGGCGTTGGATTGTGGCATGGGGTCACGGATTTGTGC本专利技术的另一个目的是提供利用上述开发的分子特异性标记引物(MDYX01F/MDYX01R)对不同曼迪亚红豆杉早期幼苗进行雌、雄性别快速、准确鉴别的方法。本专利技术采用上述分子特异性标记引物(MDYX01F/MDYX01R)作为特异性扩增引物，以待测曼迪亚红豆杉样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现610bp大小的DNA电泳条带，则待测样品为雄性个体；若电泳结果未出现610bp大小的DNA电泳条带，则待测样品为雌性个体。本专利技术分子特异性标记引物和检测方法仅适用于曼迪亚红豆杉雌雄个体的鉴别，即待测样本限定为曼迪亚红豆杉样本的范围。本领域普通技术人员可以根据曼迪亚红豆杉形态学特征以及申请人专利(CN104480210A)提供的方法进行初步的判断，再将判断为曼迪亚红豆杉的样本进行雌雄性别鉴别。采用本专利技术方法可对曼迪亚红豆杉雌雄单株进行快速的分子鉴别，方法简便、准确、快速，是形态学鉴别方法的有效补充。具体的所述方法如下：(1)剪取待测曼迪亚红豆杉样品新鲜叶片0.1～0.3g，用液氮磨碎至粉末，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组总DNA；(2)以步骤(1)提取的待测样品基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(MDYX01F/MDYX01R)作为扩增引物，进行常规PCR扩增。PCR反应体系(总体积为20μL)：2.0μL的10×Buffer(含Mg2+)，0.8μL的dNTPs(10mM)，1.0μL上游引物MDYX01F(10μM)，1.0μL下游引物MDYX01R(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，1.0μL模板DNA(50ng/μL)，13.7μL的ddH2O。PCR反应程序为：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50s，67℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后于72℃下延伸10min。(3)利用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)PCR扩增产物，然后利用凝聚成像分析仪拍照记录，如果电泳结果出现610bp的DNA电泳条带，则待测样本为雄性曼迪亚红豆杉个体；如果电泳图上未出现610bp的DNA电泳条带，则待测样本为雌性曼本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记引物，其特征在于，该分子标记为曼迪亚红豆杉雄性幼苗的特异性扩增引物，其核苷酸序列如下：上游引物MDYX01F:5’‑TCGCGCCTTTGGACGGGTGCAC‑3’，如SEQ ID NO.1所示；下游引物MDYX01R:5’‑GCACAAATCCGTGACCCCATG‑3’，如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记引物，其特征在于，该分子标记为曼迪亚红豆杉雄性幼苗的特异性扩增引物，其核苷酸序列如下：上游引物MDYX01F:5’-TCGCGCCTTTGGACGGGTGCAC-3’，如SEQIDNO.1所示；下游引物MDYX01R:5’-GCACAAATCCGTGACCCCATG-3’，如SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述的特异性标记引物在曼迪亚红豆杉性别鉴定中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于具体是：(1)提取待测曼迪亚红豆杉样品的基因组总DNA；(2)以步骤(1)提取的被测样品DNA为扩增模板，以权利要求1所述的特异性标记引物物MDYX01F/MDYX01R作为扩增引物，进行PCR扩增；(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物，利用1.2％琼脂糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈晨佳，冯尚国，罗秀俊，郑凯欣，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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