一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用，所述生物标志物检测方法为：采用包被抗体和标记抗体分别对两种不同粒径的金纳米微球进行功能化处理，然后与待检测的生物标志物发生特异性结合，使两种不同粒径的金纳米微球发生等离子共振，得到具有等离子共振散射效应的免疫纳米阵列芯片，从而实现对生物标志物的定量检测。该方法用到的金纳米颗粒的等离子共振信号稳定，采集单颗粒信号检测灵敏度高，分析速度快，简单、重复性强，并且由统计得到的检测数据更为可靠；该方法不仅可以应用于免疫检测方面，在医学、环境保护以及食品安全检测方面同样适用，适用范围很广。

A Biomarker Detection Method Based on Gold Nanosphere Plasmon Resonance and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用
本专利技术属于免疫分析
，具体涉及一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用。
技术介绍
贵金属纳米粒子，尤其是金纳米粒子，由于其独特的光学、电学性质以及良好的生物相容性，被广泛用于传感器的制备、诊疗、环境监测以及生命分析等领域。当贵金属纳米粒子的尺寸远小于入射光波波长时，在入射光的激发下，纳米粒子表面会产生局域表面等离子共振现象。近年来，由于暗场显微成像技术等在纳米材料方面的应用，实现了在单个纳米粒子水平上的实时监测，并且使传感器尺寸降低到纳米级表面，极大地提高了检测灵敏度。酶联免疫吸附测定(ELISA)作为传统的夹心免疫测定是基于抗原抗体的特异性结合并引入酶标抗体，最终通过检测酶催化反应的程度对抗原或抗体进行定量检测的实验。这种方法检测速度快、费用低廉，在一定程度上为血清标志物检测分析提供了技术支持，但仍然无法很好地满足癌症血清诊断检测需求。这种检测方法的检测限度有限，检测过程需要多步骤洗涤、繁琐耗时。更重要的是，酶标抗体不仅储存不方便，而且酶的活性容易受pH、温度等外部条件的影响，酶催化反应对实验条件的苛刻要求也限制了这种检测方法的广泛应用。因而，开发一种信号稳定、高灵敏的，具有普遍性和易于实施的生物标志物检测策略在临床诊断和治疗监测中具有的重要意义。CN102109517A公开了一种心脑血管疾病生物标志物的联合检测方法及其诊断试剂盒，即通过液相芯片的制备，形成“信号标记的检测抗体-心脑血管疾病生物标志物-捕获抗体-微球”的四联复合体，通过检测四联复合体中不同微球的标记信号，从而确定待检测样品中各种不同的心脑血管疾病生物标志物的存在及含量，本专利技术还公开了该诊断试剂盒的组成成分及该诊断试剂盒的应用。本专利技术所述的方法及试剂盒具有高通量性、高灵敏度和特异性、检测快速准确等突出优点，能够对心脑血管疾病的多种生物标志物同时进行定性和定量检测。CN107764803A公开一种运用电化学发光成像识别技术的生物标志物检测方法，首先构建电化学发光放大探针，往提取样品中加入所述电化学发光放大探针，使生物标志物与电化学发光信号放大探针连接，得到体系1；往体系1中加入捕捉探针，使生物标志物与捕捉探针连接，得到体系2；往体系2中加入链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后使生物标志物与链霉亲和素磁珠连接，然后用磁分离器分离，用PBS缓冲液冲洗；用超纯水混匀所得产物，然后置于电化学发光成像系统中检测发光信号。该专利技术的检测过程简单，经过简单的样品提取过程即可进行生物标志物监测，耗时短，省去了扩增步骤，检测快速。CN107607501A公开了一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，包括：羧基量子点修饰适配体DNA分子，金纳米粒子修饰适配体分子的互补序列，荧光淬灭体系的形成以及荧光信号的测定。该专利技术借助于三种不同生物标志物适配体修饰的三种不同发射波长的量子点作为荧光探针，通过适配体与生物标志物的识别作用，使得未与生物标志物结合的适配体将与金纳米粒子上修饰的三种对应的适配体互补序列杂交，从而导致金纳米粒子对量子点的荧光产生淬灭，通过测定体系中三种量子点荧光信号变化，从而实现对每种生物标志物的检测。该方法操作简单、灵敏度高、特异性好，能够实现生物标志物的多重检测，为疾病的快速诊断提供了一种高效的检测方法。基于上述现有技术，本专利技术开发出一种新的生物标志物检测策略，能够实现信号稳定，高灵敏性，普遍性且易于实施，其在临床诊断和治疗监测中具有的重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法，所述生物标志物检测方法为：采用包被抗体和标记抗体分别对两种不同粒径的金纳米微球进行功能化处理，然后与待检测的生物标志物发生特异性结合，使两种不同粒径的金纳米微球发生等离子共振，得到具有等离子共振散射效应的免疫纳米阵列芯片，从而实现对生物标志物的定量检测。本专利技术所涉及的生物标志物检测方法是基于金纳米微球产生等离子共振用于生物标志物检测的新方法，该方法不需要使用酶标抗体，从而克服了酶催化反应对实验条件要求苛刻的缺点；该方法用到的金纳米颗粒的等离子共振信号稳定，采集单颗粒信号检测灵敏度高，分析速度快，简单、重复性强，并且由统计得到的检测数据更为可靠；该方法不仅可以应用于免疫检测方面，在医学、环境保护以及食品安全检测方面同样适用，适用范围很广。在本专利技术中，所述生物标志物检测方法包括如下步骤：(1)制备粒径不同的第一金纳米微球和第二金纳米微球；(2)分别在步骤(1)得到的第一金纳米微球和第二金纳米微球上修饰鼠抗单抗标记抗体和鼠抗单抗包被抗体，得到修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球；(3)对步骤(2)得到的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球进行封闭；(4)将步骤(3)得到的封闭好的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球混合，再与待测生物标志物共孵育，得到具有三明治免疫夹心结构的金纳米微球混合溶液；(5)获取步骤(4)中金纳米微球混合溶液的散射光谱位移信息，根据待测生物标志物标准品建立的标准曲线计算得到待测生物标志物的含量。在本专利技术中，步骤(1)所述第二金纳米微球的粒径为40-100nm，例如40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm等。优选地，所述第一金纳米微球的粒径为5-30nm，例如5nm、10nm、15nm、18nm、20nm、22nm、25nm、26nm或30nm等。所述第一金纳米微球的粒径选择为5-30nm、第二金纳米微球的粒径选择为40-100nm的原因是：当粒径增大到一定程度后，其LSPR效应逐渐减弱，在此粒径范围内金纳米颗粒的散射光谱变化显著，适合用做对目标物的考察。在本专利技术中，所述第一金纳米微球的制备方法为柠檬酸三钠还原法。具体地，采用如下方法进行制备：将1-2％(例如1％、1.2％、1.5％或2％等)的四氯金酸溶液与超纯水混合，加热至沸腾后加入1-2％(例如1％、1.2％、1.5％或2％等)的柠檬酸三钠溶液，继续加热保持沸腾至溶液颜色无变化，再加热10-20min(例如10min、12min、14min、15min、18min或20min等)，得到所述第一金纳米微球的溶液。优选地，所述超纯水与四氯金酸溶液的体积比为(50-500):1，例如50:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1或500:1等。优选地，所述超纯水与柠檬酸三钠溶液的体积比为(3-15):1，例如3:1、4:1、5:1、8:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1等。在本专利技术中，步骤(1)所述第二金纳米微球的制备方法为种子生长法。具体地，采用如下方法进行制备：在第一金纳米微球的溶液中加入0.1-0.3M(0.1M、0.15M、0.18M、0.2M、0.25M或0.3M等)盐酸羟胺和超纯水，再在搅拌状态下加入0.01％-0.03％(0.01％、0.015％、0.02％、0.025％或0.03％等)的氯金酸溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法，其特征在于，所述生物标志物检测方法为：采用包被抗体和标记抗体分别对两种不同粒径的金纳米微球进行功能化处理，然后与待检测的生物标志物发生特异性结合，使两种不同粒径的金纳米微球发生等离子共振，得到具有等离子共振散射效应的免疫纳米阵列芯片，从而实现对生物标志物的定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法，其特征在于，所述生物标志物检测方法为：采用包被抗体和标记抗体分别对两种不同粒径的金纳米微球进行功能化处理，然后与待检测的生物标志物发生特异性结合，使两种不同粒径的金纳米微球发生等离子共振，得到具有等离子共振散射效应的免疫纳米阵列芯片，从而实现对生物标志物的定量检测。2.如权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述生物标志物检测方法包括如下步骤：(1)制备粒径不同的第一金纳米微球和第二金纳米微球；(2)分别在步骤(1)得到的第一金纳米微球和第二金纳米微球上修饰鼠抗单抗标记抗体和鼠抗单抗包被抗体，得到修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球；(3)对步骤(2)得到的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球进行封闭；(4)将步骤(3)得到的封闭好的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球混合，再与待测生物标志物共孵育，得到具有三明治免疫夹心结构的金纳米微球混合溶液；(5)获取步骤(4)中金纳米微球混合溶液的散射光谱位移信息，根据待测生物标志物标准品建立的标准曲线计算得到待测生物标志物的含量。3.如权利要求2所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(1)所述第一金纳米微球的粒径为5-30nm；优选地，所述第二金纳米微球的粒径为40-100nm；优选地，所述第一金纳米微球的制备方法为柠檬酸三钠还原法；优选地，所述第一金纳米微球的制备方法为：将1-2％的四氯金酸溶液与超纯水混合，加热至沸腾后加入1-2％的柠檬酸三钠溶液，继续加热保持沸腾至溶液颜色无变化，再加热10-20min，得到所述第一金纳米微球的溶液；优选地，所述超纯水与四氯金酸溶液的体积比为(50-500):1；优选地，所述超纯水与柠檬酸三钠溶液的体积比为(3-15):1。4.如权利要求2或3所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(1)所述第二金纳米微球的制备方法为种子生长法；优选地，所述第二金纳米微球的制备方法为：在第一金纳米微球的溶液中加入0.1-0.3M盐酸羟胺和超纯水，再在搅拌状态下加入0.01％-0.03％的氯金酸溶液，得到所述第二金纳米微球的溶液；优选地，所述第一金纳米微球溶液与盐酸羟胺的体积比为(8-12):1；优选地，所述第一金纳米微球溶液与超纯水的体积比为1:(10-15)；优选地，所述第一金纳米微球溶液与氯金酸溶液的体积比为1:(1-5)。5.如权利要求2-4中任一项所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(2)所述在第一金纳米微球上修饰标记抗体的方法为：将第一金纳米微球与标记抗体混合并反应，得到所述修饰有抗体的第一金纳米微球；优选地，所述第一金纳米微球与标记抗体的质量比为1.28×10-7:(1.5×10-4-1.5×10-2)；优选地，所述反应的时间为10-14h；优选地，所述反应的温度为20-30℃；优选地，步骤(2)所述在第二金纳米微球上修饰包被抗体的方法为：将第二金纳米微球与包被抗体混合并反应，得到所述修饰有抗体的第二金纳米微球；优选地，所述第二金纳米微球与包被抗体的质量比为1.28×10-8:(2.5×10-4-1×10-3)；优选地，所述反应的时间为10-14h；优选地，所述反应的温度为20-30℃。6.如权利要求2-5中任一项所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(3)所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：马巍，李大伟，韩焕兴，郭丹，许多，于汝佳，
申请(专利权)人：华东理工大学，蓝怡科技集团股份有限公司，浙江蓝怡医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31