一种荧光染料标记的抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种荧光染料标记的抗体及其制备方法与应用。本发明专利技术的荧光染料标记的抗体是将iFluor系列荧光染料标记在CD45抗体表面而得到的。本发明专利技术中，用带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor荧光染料标记在CD45抗体表面，通过反应、纯化及浓缩，得到iFluor荧光染料标记的CD45抗体，反应路线缩短，操作简单，产品纯度提高。

A fluorescent dye labelled antibody and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种荧光染料标记的抗体及其制备方法与应用
本专利技术是关于一种荧光染料标记的抗体及其制备方法与应用，具体地说，是关于一种iFluor系列荧光染料标记的CD45抗体、其制备方法及其应用，属于生物医药

技术介绍
近几年循环肿瘤细胞在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值显著。免疫荧光技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使荧光标记的抗体与肿瘤标志物结合，判断肿瘤细胞的存在。免疫荧光是检测循环肿瘤细胞成熟方法之一，方法简便直观，并具有可以进行形态学分析等优点。iFluorTM染料是一系列优秀的荧光染料，标记跨整个可见光谱。所有的iFluorTM染料有良好的水溶性，它们的亲水性使有机溶剂的使用达到最小化。iFluorTM染料也有好多标签性能比经典的染料荧光标记物(如FITC，TRITC，Texas和)要好，并且价格便宜，可以方便地用于标记蛋白质和核酸等生物分子。CD45由一类结构相似、分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性，通过脱磷酸作用激活Src激酶，进而激活Fyn、Hck、Lck和Lyn，导致CD3、ZAP-70和Cbl的活化，最终活化MAPK信号转导通路，从而调节细胞因子的合成和分泌。因此CD45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟、功能调节中具有重要作用。此外CD45在细胞表面存在与否可作为某些T细胞亚群的分类标志。在生物分子标记技术中，琥珀酰亚胺酯(NHS)被证明是胺修饰的最佳试剂，因为酰胺键形成的肽键本质上与天然肽键相同，并且和天然肽键一样稳定。这些试剂总体稳定，与脂肪胺反应性和选择性良好。琥珀酰亚胺酯类化合物需要考虑的因素很少，大部分活性染料溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中。胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应对pH、反应缓冲液等有较高的要求。此外，很多抗体需要依赖荧光二抗才能进行荧光免疫检测，价格昂贵，且有非特异性吸附较高等缺点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种荧光染料直接标记的抗体。本专利技术的另一目的在于提供一种荧光染料直接标记抗体的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供一种荧光染料直接标记的抗体的应用。一方面，本专利技术提供了一种荧光染料标记的抗体，其是将iFluor系列荧光染料标记在CD45抗体表面而得到的。CD45是血细胞表面的重要标志物，其抗体可作为特异探针识别外周血髓系细胞表面的CD45，对于液体活检检测、特别是循环肿瘤细胞的检测非常关键。但目前CD45抗体大多为间标抗体。而本专利技术提供的是一种荧光染料直接标记的CD45抗体。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光染料标记的抗体中，所述iFluor系列荧光染料带有琥珀酰亚胺酯基团，优选为带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor647染料。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光染料标记的抗体中，iFluor系列荧光染料与CD45抗体的摩尔比为5:1～20:1。另一方面，本专利技术还提供了所述荧光染料标记的抗体的制备方法，该方法包括：将带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor系列荧光染料直接标记在CD45抗体表面。传统标记方法中染料是不能直接偶联CD45抗体分子，是荧光染料上修饰巯基，CD45抗体上修饰Sulfo-SMCC，通过氨基和巯基交联使CD45抗体分子上带有荧光基团，完成标记反应。传统的蛋白纯化方法有盐析、亲和层析等方法，本专利技术通过超滤纯化的方法可以缩短纯化去抗体纯化时间，以及染料去除更彻底。再通过超滤浓缩得到iFluor系列荧光染料标记的CD45抗体。具体来说，可以将iFluor647标记到CD45抗体上，获得iFluor647荧光染料标记的CD45抗体(本专利技术中将iFluor647荧光染料标记的CD45抗体也称为iFluor647-CD45抗体)。本专利技术的制备方法，在特定的条件下iFluor647荧光染料直接与CD45抗体反应，反应路线缩短，操作简单，产品纯度提高，产品损失率降低。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光染料标记的抗体的制备方法中，将带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor系列荧光染料标记在CD45抗体表面的过程包括：将带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor染料溶液和CD45抗体溶液混合。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光染料标记的抗体的制备方法中，所述iFluor染料溶液和CD45抗体溶液以为0.5:1～50:1优选1:1～20:1摩尔比混合，更优选摩尔比为5:1～20:1，进一步优选5:1～15:1。优选地，所述iFluor染料溶液的溶剂为DMSO。优选地，所述iFluor染料浓度为1～50mM。更优选地，iFluor647染料浓度为5～20mM。优选地，所述CD45抗体溶液的溶剂为pH值7～9的缓冲溶液。更优选地，所述缓冲溶液为如下任何一种：Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。最优选地，所述缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。优选地，所述CD45抗体的浓度为≥0.5mg/ml。更优选地，CD45抗体的浓度为2mg/mL。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光染料标记的抗体的制备方法中，iFluor染料溶液和CD45抗体溶液通过涡旋的方法进行充分混匀；优选地，于25℃混合0.5～2h；更优选地，于25℃混合0.5～1h；优选地，于5～30Hz震荡仪混合；更优选地，于5～10Hz震荡仪混合。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光染料标记的抗体的制备方法中，所述纯化及浓缩过程包括：1)将iFluor染料溶液和CD45抗体溶液混合反应产物iFluor-CD45抗体溶于pH＝6.8～7.5的磷酸盐缓冲液中；优选地，将iFluor-CD45抗体溶解到pH＝7.2的PBS溶液中；2)将步骤1)中所得的iFluor-CD45抗体溶液转移至4mL超滤管中；优选地，超滤管截流分子量为3K～50K，更优选地，超滤管截流分子量为10K；3)将步骤2)中超滤管进行超速冷冻离心；优选地，4℃，离心力为2000～10000g，30min；更优选地，4℃，离心力为5000g，30min；4)重复步骤3)，使iFluor-CD45抗体终体积小于300μL，制得iFluor荧光染料标记的CD45抗体。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的荧光染料标记的抗体的制备方法中，可分别测定步骤4)中iFluor荧光染料和CD45抗体的浓度，计算标记率DOL。另一方面，本专利技术还提供了所述荧光染料标记的抗体的应用。除非另外指明，本文中的iFluor647染料指的是iFluor647荧光染料。除非另外指明，本文中的DOL指的是iFluor647-CD45抗体的标记率。除非另外指明，本文中的IFC指免疫荧光细胞技术。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术的荧光染料标记的抗体的制备方法包括纯化所述的iFluor-CD45抗体的过程，该纯化过程包括以下步骤(以iFluor647-CD45抗体为例进行说明)：1)将iFluor647-CD45抗体溶于缓冲液中，优选地，将iFluor647-CD45抗体溶解到pH＝6.8～7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光染料标记的抗体，其是将iFluor系列荧光染料标记在CD45抗体表面而得到的。

【技术特征摘要】
1.一种荧光染料标记的抗体，其是将iFluor系列荧光染料标记在CD45抗体表面而得到的。2.根据权利要求1所述的荧光染料标记的抗体，其中，所述iFluor系列荧光染料带有琥珀酰亚胺酯基团，优选为带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor647染料。3.根据权利要求1所述的荧光染料标记的抗体，其中，iFluor系列荧光染料与CD45抗体的摩尔比为5:1～20:1。4.权利要求1～3任一项所述荧光染料标记的抗体的制备方法，该方法包括：将带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor系列荧光染料标记在CD45抗体表面，通过纯化及浓缩，得到iFluor系列荧光染料标记的CD45抗体。5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，将带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor系列荧光染料标记在CD45抗体表面的过程包括：将带有琥珀酰亚胺酯基团的iFluor染料溶液和CD45抗体溶液混合；其中，iFluor染料溶液的溶剂为DMSO，iFluor染料浓度为5～20mM；CD45抗体溶液的溶剂为pH值为8～9的缓冲溶液，CD45抗体的浓度为2mg/mL。6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，CD45抗体溶液的溶剂缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的一种或多种；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：李男男，王皓，江涛，郭雨朦，
申请(专利权)人：北京中科纳泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11