带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体及其制备方法，所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体包括CK7、CK18、CK19三种抗体，三种抗体的比例为：CK7：CK18：CK19＝X:Y:Z，其中，X＝1、2、3、4或5；Y＝1、2、3或4；Z＝3、4、5、6、7或8。本发明专利技术的混合抗体应用于循环肿瘤细胞(CTC)检测方面，具有良好的稳定性，而且癌种适用范围广泛。

Human cytokeratin mixed antibody labeled with fluorescence and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体及其制备方法
本专利技术是关于一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体及其制备方法，具体地说，是一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体(CK7+18+19)、其制备方法以及在循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，CTC)检测方面的应用，属于生物医药

技术介绍
癌症一直是威胁人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤最显著的特征是侵袭与转移，由于自发或因诊疗操作导致肿瘤细胞从原发肿瘤脱落，发生上皮-间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)，从而使肿瘤细胞具有流动特性，并进入到外周血中，就形成了CTC。因此在外周血中检测到CTC预示着肿瘤有可能发生转移。另外，美国哈佛医学院的研究表明，原位肿瘤组织可以吸引CTC再次浸润到原发肿瘤上，促进肿瘤的生长(可参考K.Pantel等人，Nat.Rev.Clin.Oncol.2009,6,339-351；J.Kaiser等人，Science2010，327,1072-1074)。因此，高效准确地检测外周血CTC对于研究肿瘤转移机制具有指导意义，且对肿瘤患者的耐药评估、疗效评估、预后判断、复发转移监测具有重要意义。CTC在血液中的含量非常少，大约每毫升血中只有几个。自1869年澳大利亚医生ThomasAshworth首次发现CTC至今，两个世纪以来CTC的研究一直被分离技术所局限。近年来，CTC的检测技术发展出机械法和免疫分离法这两类CTC富集检测方法，CTC的生物学意义和临床价值重新受到关注。其中，免疫分离法主要是利用CTC表面的一些特异性标志物，如上皮细胞粘附因子(EpCAM)、肿瘤胚胎抗原(CarcinoEmbryonicAntigene，CEA)和人表皮生长因子受体2(HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2，HER2)等，通过抗原抗体特异性结合反应实现CTC与血液中其他细胞的分离(可参考H.Xu等人，Biomaterials2011，32,9758-9765；S.L.Stott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010，107,18392-18397；S.Nagrath等人，Nature2007，450,1235-1239；A.-E.Saliba等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010，107,14524-14529；X.Wang等人，CancerRes.2011，71,1526-1532)。机械分离方法在CTC富集和分离中，其特异性和灵敏度均低于免疫分离方法。因此人们不断改进免疫分离技术，试图提高分离效率。第一种被FDA批准用于检测CTC的是强生公司的CellSearch试剂盒。其检测原理是通过在磁珠上包被抗-EpCAM抗体识别和富集上皮组织来源的肿瘤细胞，再利用带荧光标记的抗-CKs抗体识别上皮标记物人源细胞角蛋白(Cytokeratins，CKs)的方法来鉴别CTC。CellSearch在临床上被用来做肿瘤预后评估，并在2004年被美国FDA批准作为乳腺癌转移的预后诊断方法。在这些免疫分析中，上皮细胞粘附因子(EpCAM)和CKs是循环肿瘤细胞(CTC)检测的常用表面标志物。然而，由于抗体生产成本及生产技术的限制，导致市场上的抗-CKs抗体多为单一的某种抗体，单一抗体适用的癌种范围有限，而市场上仅有的少数几种带荧光标记的混合抗体的适用范围也无法覆盖大部分癌种且抗体上偶联的荧光基团稳定性较差，因此找到一种适用癌种广泛且荧光基团稳定的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体。本专利技术的另一目的在于提供带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体的应用。为实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物，其包括CK7、CK18、CK19三种抗体，三种抗体的比例为：(1～5)：(1～4)：(3～8)。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物中，三种抗体的比例为：CK7：CK18：CK19＝X:Y:Z其中，X＝1、2、3、4或5；Y＝1、2、3或4；Z＝3、4、5、6、7或8。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物中，所述CK7、CK18、CK19抗体均为Alexa488标记的兔单克隆抗体。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物，还包括抗体稀释液。本专利技术中，除特别注明外，所述混合抗体中三种抗体的比例为“稀释比例”。“稀释比例”义为工作浓度或工作浓度特定倍数中单一抗体的含量，混合抗体配比根据三种抗体各自计算值加入后定容至要求体积。另一方面，本专利技术还提供了一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体，其是所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物中的三种抗体，与抗体稀释液混合配制而成的。根据本专利技术的具体实施方案，所述抗体稀释液为含3g/100mL封闭用血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)。另一方面，本专利技术还提供了所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体的制备方法，该方法包括：将CK7、CK18、CK19分别用抗体稀释液稀释，得到浓度为0.25-10μg/ml的抗体工作液；将CK7、CK18、CK19抗体工作液按比例混合，得到带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体；其中，所述混合抗体中，CK7、CK18、CK19三种抗体的比例为：(1～5)：(1～4)：(3～8)。根据本专利技术的具体实施方案，优选地，所述混合抗体中，CK7、CK18、CK19三种抗体的比例为CK7：CK18：CK19＝X：Y：Z；其中，X＝1、2、3、4或5；Y＝1、2、3或4；Z＝3、4、5、6、7或8。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备方法中，所述抗体稀释液的成分为每100mL磷酸盐缓冲液(PBS)包括3g封闭用血清白蛋白。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的制备方法中，各抗体工作液中：CK7抗体浓度为2.5-5μg/ml；CK18抗体浓度为0.2-2.5μg/ml；CK19抗体浓度为0.4-3.5μg/ml。另一方面，本专利技术还提供了所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物或所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体在制备外周循环肿瘤细胞(CTC)检测剂中的应用。所述混合荧光抗体具有良好的稳定性，而且癌种适用范围广泛。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的应用中，所述肿瘤包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌细胞中的一种或多种。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的应用中，所述肿瘤细胞包括SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、HeLa、HepG2、HCT-8、H1650、H1975、SNU-5和PC-3中的一种或多种本专利技术的有益效果：本专利技术所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体具有良好的稳定性，在不增加抗体成本、不影响抗体性能的前提下克服了单一抗体适用癌种范围受限的问题，使抗体的适用范围覆盖绝大部分上皮来源的循环肿瘤细胞(CTC)，使人源细胞角蛋白(CK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物，其包括CK7、CK18、CK19三种抗体，三种抗体的比例为：(1～5)：(1～4)：(3～8)。

【技术特征摘要】
1.一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物，其包括CK7、CK18、CK19三种抗体，三种抗体的比例为：(1～5)：(1～4)：(3～8)。2.根据权利要求1所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物，其中，三种抗体的比例为：CK7：CK18：CK19＝X：Y：Z其中，X＝1、2、3、4或5；Y＝1、2、3或4；Z＝3、4、5、6、7或8。3.根据权利要求1所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物，其中，所述CK7、CK18、CK19抗体均为Alexa488标记的兔单克隆抗体。4.根据权利要求1～3任一项所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物，该组合物还包括抗体稀释液。5.一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体，其是权利要求1～3任一项所述的带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体组合物中的三种抗体，与抗体稀释液混合配制而成的。6.一种带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体的制备方法，该方法包括：将CK7、CK18、CK19分别用抗体稀释液稀释，得到浓度为0.2-10μg/ml的抗体工作液；将CK7、CK18、CK19抗体工作液按比例混合，得到带荧光标记的人源细胞角蛋白混合抗体；其中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：江涛，王皓，李男男，仇海燕，
申请(专利权)人：北京中科纳泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11