一种定量检测抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了属于生物工程技术领域的一种定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成，本发明专利技术试剂盒成本低，主要试剂均以工作液形式提供，操作简便，能同时快速检测大批样品；具有高灵敏度、高特异性的特点；是目前国内乃至国际首个能定量特异检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的试剂盒。

An ELISA Kit for Quantitative Detection of Herbicide Resistant Protein Bar

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种定量检测抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
转有抗除草剂基因作物的种植，使在田间喷洒除草剂成为有效防除杂草方式，也因而使抗除草剂性状成为农业生产中最具优势的性状之一。目前，抗除草剂作物占全球转基因作物的80％以上。从发展趋势上看，转基因的作物比例仍在不断增加。链霉菌(streptomyces)中Bar基因表达的蛋白在乙酰辅酶A存在的情况下能催化乙酰辅酶A与除草剂草铵膦的游离氨基结合，使L-草铵膦变为乙酰-L-草铵膦，从而使除草剂失活，赋予转基因作物抗除草剂特性。Bar基因作为遗传转化中的标记基因广泛应用于基因工程育种中。随着转基因作物的飞速发展带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题。因此建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物的安全管理，保障人、动物以及微生物的安全，能够保护生态环境。为了对转基因水稻或者其衍生物中Bar蛋白进行快速的定量或定性分析，研究并得到抗除草剂Bar蛋白的单克隆抗体具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；其中，样品处理液为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Bar单抗杂交瘤细...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；其中，样品处理液为：1MTris,pH7.5500uL，1MNaCL1.5mL，0.5MEDTA20uL，50％甘油2mL，10％SDS1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/1B83D6鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；标准品为100ng的His-Bar重组蛋白；辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA1g，0.05％的吐温200.05mL，0.1％的NaN30.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；浓缩洗涤液为含有1.0％Tween-20的10×PBS；底物溶液为0.5mL2mg/mLTMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL30％H2O2混合，现用现配；终止液为1MH2SO4。2.根据权利要求1所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体由保藏号为CGMCCNo.17084的Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/6F51D2分泌得到的，捕获抗体的检测范围1.5625ng/mL-100ng/mL。3.根据权利要求1所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述检测抗体由保藏号为CGMCCNo.17083的Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/1B83D6分泌得到。4.根据权利要求1所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述His-Bar重组蛋白是通过将Bar编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-Bar转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白Bar表达菌株复苏培养，用IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到。5.根据权利要求2、3所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/6F51D2和Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/1B83D6是用原核表达的重组蛋白Bar免疫BALB/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞与商品化的小鼠杂交瘤细胞SP2/0融合，用HAT培养基筛选得到。6.权利要求1-5所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫晓，张哲，金芜军，高进，董美，王迪，苗朝华，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11