本发明专利技术属于鱼类技术领域，具体公开了青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用。申请人成功筛选并合成6对青鱼荧光标记微卫星引物，该引物可用于建立青鱼亲子鉴定技术，并且公开了所使用的亲子鉴定试剂盒。本发明专利技术首次在青鱼上建立了亲子鉴定的方法，其鉴定准确率达到了100%。通过家系的筛选和鉴定，可以减少在青鱼群体选育中存在的近亲繁殖现象，更有利于实现家系选育，从而加快选育的进程，提高选育效果。
Application of SSR-labeled primers in parentage identification of black carp
【技术实现步骤摘要】
青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用
本专利技术涉及鱼类分子标记辅助选择领域，具体涉及青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用。
技术介绍
青鱼(Mylopharyngodonpiceus)隶属硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，青鱼属，主要分布于我国长江以南的平原地区，长江以北较稀少；它是长江中、下游和沿江湖泊里的重要渔业资源和各湖泊、池塘中的主要养殖对象，为我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，也是“四大家鱼”中生长最快的鱼类。其食性广、成本低、生长快、成活率高、易捕捞，能在池塘中产卵繁殖，繁殖，且消费市场需求极大，因此被作为优良的杂食性鱼类品种在全国范围内普遍推广。近年来，青鱼消费市场的畅销品种，养殖经济效益较好，因而市场对青鱼优良苗种的需求十分迫切。但由于青鱼苗种生产中普遍存在近亲繁殖的现象，导致种质退化加剧，常规苗种的生长速度较慢，不仅影响了青鱼的生长性能，而且在定程度上制约了青鱼在更大范围的推广。在鱼类遗传育种中，准确的系谱记录对于育种计划的制定具有关键性作用。由于鱼类所处的环境特点以及繁有过程中自然交配、混合受精等原因，常常造成个体系谱不明确。对于鱼类来说，为了保持家系信息，对不同的家系实施分池养殖存在所需水体大、管理强度人的缺陷，同时，大大限制了家系的数目，不利于得出正确的估计值，更重要的是，不同的环境因素影响了不同家系的性状，使有种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于有种计划的制定:在混合养殖群体中保持家系信息，在鱼类上应用的传统的物理标记方法有剪鲭、烙印、体外标编码金属标、被动整合雷达标、荧光染料、电子芯片等。其中一些标记在家育上应用较广泛也有良好的效果，如电子芯片。但是对水产动物尤其是鱼类来说，由于其所处的水体环境及值体自身的特点，使用物理标记存在操作繁琐、易损伤鱼体、对生长造成一定影响、标记保存时间不长等缺陷。而且，物理标记不适用于仔鱼或幼鱼，因此，在育种时首先需要对各家系分池养殖，待到可以进行物理标记时才能实施混养。这样不仅增加了养殖成本，更重要的是引入了环境误差。因此，对于鱼类个体标识、家系鉴定直是难以解决的问题，这在很大程度上限制了良种选自工作的开展。微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点，为水产动物选育中保持家系信息、确认亲缘关系、追踪系谱提供了有用的工具。如果已知父母的基因型，微卫星标记能在没有外部物理标记且不需要分开养殖的情况下区分出混养群体中个体所属的家系。有关研究(革世瑞等2008；Wangetal.2009；Luoetal.2014；Luoetal.2017)证实了微卫星在水产动物研究中确认父母本和分析家系关系中的应用价值。目前尚末见将微卫星标记应用于青鱼家系鉴定的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用，为青鱼遗传育种提供了必要的分子标记，为实施青鱼家系育种规划提供理论依据。为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术措施：青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用，包括利用本领域的常规方式，利用本专利技术提供的引物组对青鱼进行亲子鉴定；或是利用该引物组制备成青鱼亲子鉴定试剂盒。所述的引物组如下：Mpi-142F:ACGCTGACCTTCCGTTTATG(5’-3’)R:CATGACTCGCTGAAACATGA(5’-3’)Mpi-239F:GGATGAGTTCTCCCAGAGACA(5’-3’)R:GCACCACTGCTAAAAACAAACA(5’-3’)Mpi-255F:TTACCCTGGTACATGTTGTGC(5’-3’)R:GCAAGTCAAACCAATCAATC(5’-3’)Mpi-260F:CATTGATGGTTCCACGATGA(5’-3’)R:CAAACCTTGGAACTTGCACA(5’-3’)Mpi-376F:TTTCCTGAGGGCAAGAACAC(5’-3’)R:GACCTTTCCCTTTGCTACCC(5’-3’)Mpi-519F:CCTTCCAGCTCTATCTGTCTG(5’-3’)R:ACCGAAGGACTGCAGAGTGT(5’-3’)与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术可用于鉴定不同家系子代混养的种群，不需要将各家系子代采用水族箱或水泥池分开放养，可极大节省人力、物力和财力。2.本专利技术提供的引物对青鱼亲子鉴定的准确性达到了100％。3.本专利技术对正向引物进行了荧光标记，并基于6个微卫星位点PCR扩增产物的大小，将三种不同颜色(FAM、ROX、HEX)荧光引物扩增的PCR产物混合为一个基因型分析样品，极大的节省的基因型分析的费用。附图说明图1为Mpi-142/Mpi-519/Mpi-255三个微卫星位点PCR扩增产物在基因分析仪上所显示的基因型示意图；其中，标记1是Mpi-142位点PCR扩增产物峰图；2是Mpi-519位点PCR扩增产物，3是Mpi-255位点PCR扩增产物；4是荧光标记的标准片段(GeneScanTM500LIZTMSizeStandard)。图2为Mpi-239/Mpi-260/Mpi-376三个微卫星位点PCR扩增产物在基因分析仪上所显示的基因型示意图；其中，标记1是Mpi-239位点PCR扩增产物，2是Mpi-376位点PCR扩增产物，3是Mpi-260位点PCR扩增产物；4是荧光标记的标准片段(GeneScanTM500LIZTMSizeStandard)。具体实施方式以下为本专利技术的具体实施方案。实施中所涉及到的仪器、试剂均为购买商品。以下列出一些主要设备及试剂来源：1.主要仪器(1)MilliporeQSynthesis超纯水系统(2)日本三洋SIM-F140制冰机(3)日本三洋MU53V519L超-80℃低温冰箱(4)微量移液器(Eppendorf)(5)QiagenTissueLyserII核酸提取样品处理系统(6)ThermoScientificCL31Multispeed离心机(7)Bio-RadDNAEnginepeltierThermalCyclePCR仪(8)NanoDropND-2000紫外分光光度仪(9)AlphaInnotech公司的AlphamagerEP凝胶成像系统(10)ABI3730基因分析仪2.主要试剂TaqDNA聚合酶，Buffer(含Mg2+)，dNTPs，购自中国天根生化科技有限公司；各微卫星位点正向荧光标记引物由美国ABI公司合成，GeneScanTM500LIZTMSizeStandard购自美国ABI公司；其它普通化学试剂和分析纯均购自上海生工生物工程有限公司和天根生化科技有限公司。实施例1：青鱼亲子鉴定微卫星标记的筛选：从武汉青鱼场亲鱼群体中挑选了5条优良父本和4条母本，提取DNA后进行多态性SSR标记的筛选；从已发表的青鱼微卫星位点中选取位点进行PCR扩增，PCR反应体系为10μL：2xEsTaqMasterMix(Dye)5μL、ddH2O4μL、正反引物各0.25μL、模板DNA0.5μL。热循环参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃保存5min，降温至10℃保存。PCR扩增后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析青鱼亲本的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用；所述的引物组如下：Mpi‑142F: ACGCTGACCTTCCGTTTATG（5’‑3’）R:CATGACTCGCTGAAACATGA（5’‑3’）Mpi‑239F:GGATGAGTTCTCCCAGAGACA（5’‑3’）R:GCACCACTGCTAAAAACAAACA（5’‑3’）Mpi‑255F:TTACCCTGGTACATGTTGTGC（5’‑3’）R:GCAAGTCAAACCAATCAATC（5’‑3’）Mpi‑260F:CATTGATGGTTCCACGATGA（5’‑3’）R:CAAACCTTGGAACTTGCACA（5’‑3’）Mpi‑376F:TTTCCTGAGGGCAAGAACAC（5’‑3’）R:GACCTTTCCCTTTGCTACCC（5’‑3’）Mpi‑519F:CCTTCCAGCTCTATCTGTCTG（5’‑3’）R:ACCGAAGGACTGCAGAGTGT（5’‑3’）。
【技术特征摘要】
1.青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用；所述的引物组如下：Mpi-142F:ACGCTGACCTTCCGTTTATG（5’-3’）R:CATGACTCGCTGAAACATGA（5’-3’）Mpi-239F:GGATGAGTTCTCCCAGAGACA（5’-3’）R:GCACCACTGCTAAAAACAAACA（5’-3’）Mpi-255F:TTACCCTGGTACATGTTGTGC（5’-3’）R:GCAAGTCAAACCAATCAATC（5’-3’...
【专利技术属性】
技术研发人员：王红辉，
申请(专利权)人：湖北武汉青鱼原种场，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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